第一部分携带人livinα基因重组腺病毒载体的构建与鉴定[实验背景]Livin基因是近年来发现的一种新的抗凋亡基因,它有两种剪接异构体分别命名为livinα和livinβ。由于livin的抗凋亡活性以及其在多数肿瘤组织中高表达,在大多数正常成人组织中含量甚微或不表达的特点,使得它有可能成为肿瘤免疫治疗的良好靶点,因此针对livin抗原为靶抗原构建以树突状细胞(Dendritic cells, DCs)为基础的肿瘤疫苗可能具有良好应用前景。近年来,随着体外分离和培养DCs技术的完善,把肿瘤抗原或基因导入DCs中制成DCs疫苗进行抗肿瘤免疫治疗研究已倍受关注,而有效的基因转移方式是抗肿瘤免疫治疗的关键。利用重组腺病毒载体(recombinant adenovirus, rAd)介导目的基因转入DCs是实现基因转移的有效方法。本部分研究旨在通过AdMax系统构建携带人livinα基因和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因的重组腺病毒,为下一步感染DCs制成DCs疫苗进行抗肿瘤免疫治疗研究奠定基础。[实验目的]利用AdMax系统构建携带人livinα基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组腺病毒载体(rAd-hlivinα)。[实验方法]以质粒pIRES2-EGFP-hlivinα为模板,通过PCR扩增出人livinα基因cDNA片段,再将人livinα基因cDNA亚克隆于腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv,获得重组腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv-hlivinα。此重组质粒经双酶切及插入片段测序鉴定,将鉴定正确的重组腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv-hlivinα与腺病毒辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre通过脂质体2000共转染HEK293细胞,两质粒在HEK293细胞中同源重组获得重组腺病毒rAd-hlivinα, PCR鉴定此病毒后,将鉴定正确的重组腺病毒在HEK293细胞中扩增,制备高滴度病毒液,用TCID50法测定病毒滴度。[实验结果]结果显示,双酶切重组腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv-hlivinα结果符合预期片断大小,插入片段测序结果符合Genebank中报告的人livinαcDNA序列。感染的HEK293细胞内能观察到重组腺病毒rAd-hlivinα绿色荧光蛋白的表达。rAd-hlivinα经PCR鉴定特异性的扩增出符合预期大小的片断。病毒滴度为2.7×1010TCID50／毫升。[实验结论]通过AdMax系统成功构建了重组腺病毒rAd-hlivinα,且达到较高滴度。这是首次报道利用AdMax系统构建携带人livinα基因和报告基因EGFP的重组腺病毒载体,为下一步开展DCs疫苗的肿瘤免疫治疗实验奠定了基础。第二部分重组腺病毒介导人livinα基因修饰的小鼠DCs疫苗的构建与鉴定[实验背景]树突状细胞(dendritic cells, DCs)是目前已知人体内专职的、最强的抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC),它能同免疫反应系统中的许多细胞相互作用,处于免疫反应的中心地位,能够激活机体先天性和获得性免疫应答反应,其通过向T淋巴细胞提呈抗原,诱发细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)效应而发挥抗肿瘤免疫作用。目前,以DCs为基础的肿瘤疫苗在动物和临床研究中取得了许多进展,已成为肿瘤免疫治疗的热点之一。利用肿瘤抗原基因修饰DCs制成DCs疫苗来诱导机体产生抗肿瘤免疫反应已成为肿瘤免疫治疗的一条重要途径,而其中应用复制缺陷型重组腺病毒载体把目的基因转入小鼠或人DCs中,是实现基因转移的有效方式,也是基础研究中广泛应用的载体。到目前为止,腺病毒介导的基因治疗是最有前途的治疗方法之一。本部分研究中将利用在第一部分成功构建的重组腺病毒rAd-hlivinα载体,将人肿瘤抗原基因livinα通过重组腺病毒转入小鼠骨髓DCs中,制备人livinα基因修饰的DCs疫苗,为后续针对小鼠肺癌治疗的免疫学研究提供实验基础。[实验目的]将人livinα基因通过重组腺病毒载体转入小鼠骨髓DCs中,实现人livinα在DCs中高效表达,制备人livinα基因修饰的DCs疫苗。[实验方法]1.用淋巴细胞分离液体外分离C57BL／6小鼠骨髓单个核细胞,加入含有20纳克／毫升GM-CSF和10纳克／毫升IL-4的RMPI1640完全培养基体外诱导培养。2.培养第7天,收集细胞,分成三组,空白组(DCs组)、对照腺病毒rAd-control感染组(rAd-c DCs组)及重组腺病毒rAd-hlivinα感染组(rAd-hlivinαDCs组)。感染复数(multiplicity of infection, MOI)是200。3.感染细胞继续培养48小时后,收集重组腺病毒感染的DCs用流式细胞仪检测荧光阳性细胞比例和使用台盼蓝染色法评价感染后的细胞活力。4.流式细胞仪分析感染和未感染DCs的表型。5.收集rAd-hlivinα感染的DCs (rAd-hlivinαDCs)和1Ad-control感染的DCs(rAd-c DCs),用Western blot检测人livinα蛋白的表达。[实验结果]1.分离小鼠骨髓单个核细胞进行体外培养,镜下可见许多典型树突状细胞。2.MOI为200时,重组腺病毒感染效率为75%,细胞活力为90%,因此MOI200被认为是一个较佳的感染复数值。3.重组腺病毒感染的DCs(包括rAd-hlivinαDCs和rAd-c DCs)与未感染DCs比较,可明显提高了细胞表面分子CD80、CD86和MHCⅡ的表达(P<0.05)；而在rAd-hlivinαDCs和1Ad-c DCs中表面分子表达无明显差别。4. Western blot方法分析显示,经rAd-hlivinα感染的DCs可有效表达人livinα蛋白,而rAd-control感染的DCs不能检出livinα蛋白表达。[实验结论]利用重组腺病毒rAd-hlivin a载体,把人livinα基因成功转移入DCs中,并实现了人livinα蛋白在DCs中的高效表达。感染后的DCs表面标志物的表达上调,成熟度得到提高。本部分研究成功制备的rAd-hlivinα感染的DCs疫苗为后续利用疫苗进行抗肺癌的免疫学研究奠定了基础。第三部分重组腺病毒rAd-hlivin a感染树突状细胞抗小鼠Lewis肺癌的免疫学研究[实验背景]Livin是近年来发现的一种肿瘤抗原,它是凋亡抑制蛋白(inhibitor apoptosis protein,IAP)家族的成员之一。与另一IAP家族成员survivin相似,livin在大多数肿瘤细胞中过表达,而在正常成人大多数组织不表达。尽管livin在组织中的表达特性类似于survivin,但有研究认为livin的抗凋亡活性更强于survivin。有研究报道livin蛋白过表达在许多肺癌细胞株和原发性肺癌中,许多肺癌病人体内存在livin抗体和抗livin的细胞免疫反应。这说明livin在肺癌的发生和发展中起着重要的作用,因此livin可能成为肺癌免疫治疗的良好靶位。由于机体中枢免疫耐受的存在,自身蛋白(如livin)或许并不能刺激患病机体产生强有力的抗肿瘤免疫反应,然而如果采用不同物种的同源蛋白在蛋白质序列上的小差异却能打破机体对天然抗原的免疫耐受。为了探讨异种livin蛋白的免疫原性,本部分研究应用携带人livinα基因的重组腺病毒(rAd-hlivinα)感染小鼠DCs制成的DCs疫苗免疫接种小鼠,来观察其抗小鼠肺癌移植瘤的免疫学效应。[实验目的]应用携带人livinα基因的重组腺病毒(rAd-hlivinα)感染小鼠DCs制成的DCs疫苗免疫接种小鼠,来观察其抗小鼠肺癌移植瘤的免疫学效应。[实验方法]1.应用Western blot和免疫组化的方法检测Lewis肺癌细胞livin蛋白的表达。2.制作C57BL／6小鼠Lewis肺癌(LLC)皮下移植瘤模型,取肿瘤组织HE染色。3.在疫苗的预防实验中,雌性C57BL／6小鼠被随机分成3组,在每组小鼠左肋腹侧皮下接种rAd-hlivinα感染的DCs (rAd-hlivinαDCs)、rAd-control对照病毒感染的DCs (rAd-c DCs)或DCs,每只小鼠都接种3次,每次间隔7天,在第三次预防接种7天后,在每只小鼠的右肋腹侧皮下接种LLC细胞,然后观察8周,计算小鼠的存活率。4.在疫苗的治疗实验中,雌性C57BL／6小鼠右肋腹侧皮下接种LLC细胞,接种后第8天,把荷瘤鼠随机分成3组,每组小鼠左肋腹侧皮下接种疫苗rAd-hlivinαDCs、rAd-c DCs或DCs,共接种3次,每隔三天一次,第一次接种疫苗后每2天,测量肿瘤的长径和短径,并计算肿瘤的体积。在LLC细胞皮下接种后,观察7周,计算小鼠存活率。5.C57BL／6小鼠皮下免疫接种rAd-hlivinαDCs、rAd-c DCs或DCs,每周免疫1次,共接种2次,第二次免疫后1周处死小鼠,取其脾脏按常规方法制成淋巴细胞悬液,作为效应细胞,分别以Lewis肺癌细胞株为靶细胞,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL的活性,效／靶比分别为20：1、40：1、60：1。[实验结果]1.LLC细胞免疫组化显示细胞胞浆被染成棕黄色,表明细胞中存在鼠livin蛋白的表达；Western blot检测显示LLC细胞表达鼠livin蛋白,这与LLC细胞爬片免疫组化的结果一致。2.C57BL／6小鼠右肋腹侧皮下接种5×105个LLC细胞后,8-10天观察到小鼠皮下长出肿瘤,取LLC皮下移植瘤组织HE染色,镜下可见肿瘤细胞大小明显不等,排列紊乱,易见病理性核分裂相。3.肿瘤特异性CTL的检测显示免疫接种了rAd-hlivinαDCs的小鼠产生的CTL对靶细胞产生了的显著的杀伤效应,且随着效／靶比提高,杀伤率亦相应增高。4.在预防实验中,通过56天的观察,免疫接种rAd-hlivinαDCs的小鼠产生了显著的抗Lewis肺癌的效果,导致了小鼠的完全存活,与免疫接种rAd-c DCs的小鼠或免疫接种DCs的小鼠生存率比较有显著差异(Kaplan-Meier分析,P<0.001)。5.在治疗实验中,用rAd-hlivinαDCs疫苗治疗能显著抑制Lewis肺癌的生长。在24天的观察期内,皮下接种]Ad-hlivinαDCs治疗对小鼠肿瘤生长的抑制作用非常明显(第12天时,P<0.01；第14-24天时,P<0.001),肿瘤生长延缓；在第16-24天,rAd-hlivinαDCs治疗组肿瘤体积至少小于对照组(rAd-c DCs组或DCs组)2倍。在48天的存活率观察期内,rAd-hlivinαDCs治疗组荷瘤小鼠10只中有5只存活,其生存率与rAd-c DCs组或与DCs组比较有显著差异(Kaplan-Meier分析,P<0.001)；而rAd-c DCs组与DCs组荷瘤小鼠生存率无显著差异。[实验结论]使用rAd-hlivinαDCs疫苗能诱导出鼠livin表位的肿瘤特异性免疫反应,并产生强烈的抗Lewis肺癌的效应。这一结果表明利用人和鼠在氨基酸序列上的异同或许是研制具有更强免疫原性肿瘤疫苗的良好策略。