论文部分内容阅读
背景与目的:慢性髓性白血病(CML)是一种起源于多能造血干细胞的髓系增殖性肿瘤。美国FDA在2001年批准了一种新型酪氨酸激酶抑制剂(TKI)甲磺酸伊马替尼(IM),成为CML治疗的首选药物。但随着临床开展的深入和时间的推移,IM耐药逐渐显现。因此迫切需要研究新的治疗方法克服或逆转IM耐药,以提高患者的预后。如今肿瘤细胞增殖的信号通路及分子机制已成为新的研究热点。p14ARF→Mdm2→p53通路,即p53通路,是近些年来研究较多的信号通路,在调节肿瘤细胞增殖过程中起着重要作用。p14ARF可通过p53依赖途径或p53非依赖途径发挥效应。但关于p53通路及p14ARF等信号分子在CML细胞增殖中的作用却知之甚少。为明确p14ARF→Mdm2→p53通路CML细胞增殖过程中的作用,我们一方面从Bio Models Database数据库中获取p53信号途径相关模型,使用COPASI软件对相关信号分子进行系统生物学分析,从理论上论证该通路及相关分子在CML发生及进展过程中的作用。我们还进一步针对系统生物学结果进行实验验证,选择p14ARF基因转导K562细胞系及CBL-BC细胞,初步探讨p14ARF对慢性髓性白血病细胞增殖及细胞凋亡的影响。为进一步研究CML细胞增殖的信号通路和分子机制提供依据,有利于新疗法的开发研制。提高CML的治疗效果,改善患者的生存和预后。方法:从Bio Models Database数据库中搜索关键词p14ARF、Mdm2、p53,查找文献资料:Explaining oscillations and variability in the p53-Mdm2 system(Proctor CJ,Gray DA.BMC Syst Biol 2008;2:75),获取p53信号途径相关模型,下载SBML L2V3(.xml)。以时间(s)为横轴,设定总时程、区间大小及总区间,以变量的浓度(mol/L)为纵轴。运行软件COPASI-4.16.104,得到不同信号分子的浓度振荡曲线,进行分析。将抑癌基因p14ARF通过慢病毒载体基因转导系统导入K562细胞系及4例CML急变期患者的原代白血病细胞,将转染空载体的细胞作为对照组。用荧光显微镜及流式细胞术检测转导效率;用荧光显微镜计数细胞菌落数;用Annexin V-FITC/PI标记流式细胞术检测细胞凋亡。结果:系统生物学分析:ARF、Mdm2在体内均维持在较低浓度水平,其极小的幅度变化即可引起p53较大的波动。该通路的总体趋势为p14ARF↑→Mdm2↓→p53↑。Mdm2-m RNA的转录迟于p53的表达。p14ARF→Mdm2→p53通路稳定p53的水平主要是通过抑制p53的降解而非促进p53的合成。p53的稳态浓度增长速率与ARF的浓度增长速率不成正比。基础实验:HIV-hr GFP感染CML细胞,当病毒与细胞的比例(MOI)=50时K562细胞系的转导效率接近100.00%,CML-BC1,CML-BC2,CML-BC3,CML-BC4的转导效率分别为(98.00±1.73)%、(77.00±1.63)%、(89.00±2.65)%、(87.00±1.41)%。应用半固体培养的方法比较实验组与对照组间的白血病细胞集落形成差异,与转染空载体组相比,差异有统计学意(P<0.05)。应用Annexin V-FITC/PI双染色法分析导入p14ARF基因后CML细胞的凋亡细胞百分比。结果显示导入p14ARF的K562细胞的凋亡率仅为20%,而4组CML原代细胞的凋亡率均比对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:无论是系统生物学还是基础实验均证实p14ARF是一种抑癌基因。p14ARF→Mdm2→p53通路中p14ARF通过抑制Mdm2的表达,影响细胞内p53的水平,其极小的幅度变化即可引起p53较大的浓度波动。p53通路的总体趋势为p14ARF↑→Mdm2↓→p53↑,但存在p53、Mdm2的降解-反式激活循环通路。p53通路中p53水平的稳定及恢复主要是通过抑制p53基因降解的速率,而非增加p53的生成速率。p14ARF导入CML细胞后,细胞增殖受抑,诱导凋亡,可作为新的基因治疗的靶点。