昆虫病原线虫共生细菌寄生于昆虫病原线虫肠道内，二者互惠共生。该菌对昆虫有很强的致病力，大部分共生菌注射到昆虫血腔内，LD₅₀仅为1-10个活细胞。Bowen（1998）首次报道Photorhabdus luminescens的W-14菌株能产生对昆虫有胃毒活性和血腔毒性的杀虫蛋白，这一结果引起了国际学者对共生细菌的关注，因此有关该菌杀虫物质及其杀虫机制的研究日益成为国际研究的热点。我国对昆虫病原线虫的研究较多，但对其共生菌的研究十分薄弱，有关共生菌杀虫物质的研究在国内尚属空白。 本研究选取有代表性的11个菌株为实验材料，提取其胞外杀虫物质，检测胃毒活性和血腔毒性，筛选得到采自我国的Xenorhabdus bovienii A54菌株为高毒力的菌株。论文首次在国内外对X.bovienii产生的大分子胞外杀虫物质及其特性进行研究，该项目的研究可以提供新的杀虫资源，为杀虫物质的开拓作出贡献；同时这一研究也有助于揭示共生细菌的致病机制。现将主要研究结果总结如下：1.比较研究了11个菌株胞外分泌物的杀虫活性。结果表明，不同菌株产生的杀虫毒素不同；其中5个菌株能同时产生血腔和胃毒两种毒素，3个菌株只产生血腔毒素，3个菌株既无血腔毒素又无胃毒素的产生。另外，不同菌株杀虫毒素致病力强弱也各不相同：从血腔毒性上看，菌株HZL和15-2毒性最高，A54、BJ、ALL、CB-8、Meg毒性次之，D43毒性较差；从胃毒活性上看，A54致死活性最高，BJ、ALL、D43、15-2致死作用弱，仅对昆虫的生长有抑制作用。2.筛选出X.bovienii A54菌株为高毒力的菌株。粗提物注射大蜡螟老龄幼虫，96hr死亡率为93.3％；粗提物饲喂玉米螟和棉铃虫初孵幼虫，120hr死亡率分别为100％和90.7％。这一结果表明采自我国吉林的A54菌株有很好的杀虫活性，是很有利用价值的一种细菌资源。3.从胞外分泌物入手，研究比较A54菌株Ⅰ、Ⅱ型菌产生胞外蛋白的差异，首次开展共生菌的型态变异同其杀虫活性关系的研究。电泳结果表明，Ⅰ、 中囚农科院博十研究生学位论文 11型的产生的胞外蛋白存在很大差异：11型菌产生的胞外蛋白都能为1型 菌产生，而且1型菌的产生量要高于11型菌：另外，1型菌产生的胞外蛋 H种类也多十＊型菌。通过测定1、11型菌胞外产物的杀虫活性，发现1 型菌的胞外产物对昆虫有胃毒活性和血腔毒性，11型菌没有杀虫活性， 这 研究结果为今后本领域研究共生菌胞外杀虫物质的试验方法提出警 小，必须保证实验所用共生细菌不发生型变，否则将无法获得杀虫物质。4．色谱杜层析的结果表明，菌株M4产生的胃毒素和血腔毒素为两类不同 的杀虫物质：初步鉴定该胃毒素为多糖类物质，这一发现在国内外尚属 首次。对A54胃毒素的研究表明，该毒素可被85％饱和度的硫酸铰沉淀， 个能通过透析膜（截留分子量＞10kD）。采用饲喂棉铃虫初孵幼虫的杀虫 活性追踪检测，通过硫酸按盐析、阴离子交换柱层析、阳离子交换柱层 析等方法，对该毒素进行了分离纯化。用红外光谱初步鉴定，该毒素为 多糖类物质。经计算每升发酵液胃毒素的产量约为 1．ling。理化特性分析 表明，该毒素的分子量约为门兀D：在3炉＊一80”C范围内杀虫活性稳定： 对氯仿和正丁醇敏感，对甲醇相对稳定；随着胃毒素浓度的提高，棉铃 虫幼虫的死亡率增加，胃毒素对棉铃虫初孵幼虫的致死中浓度为30．08pg／g （胃毒素／饲料）。该毒素对较高龄期棉铃虫幼虫生长有一定的抑制作用。5．初步研究了胃毒素对棉铃虫的生理效应。通过对棉铃虫解毒酶的活力测 定分析，发现取食胃毒素后，棉铃虫体内。乙酸蔡酯酶的活力增加，乙 酚胆碱酯酶和谷脱甘肽转移酶的活力变化不大，结果说明a－乙酸蔡酯酶 是棉铃虫体内参与胃毒素代谢作用的一种解毒酶。比较对照棉铃虫和取 食胃毒素的感病棉铃虫体内总蛋白的含量，发现感病棉铃虫体内蛋白质 的含量明显卜降。酯酶同工酶的分析结果表明，与对照棉铃虫相比，感 病棉铃虫幼虫酯酶谱带数少，颜色浅，酯酶同工酶的活力减弱。︽首次从组织病理学的角度研究了胃毒素的杀虫机制。利用光学显微镜观察棉铃虫幼虫的中肠组织，发现取食胃毒素后，棉铃虫中肠组织发生病变，围食膜脱落，肠壁细胞逐渐降解，中肠细胞排列疏松混乱。利用电镜观察中肠细胞的超微结构变化，发现取食胃毒素后，棉铃虫中肠微绒毛肿胀、变形、脱落，内质网减少，中肠细胞自溶、出现空泡。 5 摘 要7．研究测定了A54胃毒素与Bt毒蛋白对棉铃虫的交互作用。结果发现随着 棉铃虫／’kJ料中 A54胃毒素和 Bt毒蛋臼浓度的增加，棉铃虫幼虫的死亡率 均显著卜升；方差分析的结果表明二者互有增效作用。这一结果为探索 穴小荫的胞外产物可成为Bt的增效剂提供了佐证。8．在囚内外召次揭示X bovienii A54菌株能产生对大蜡螟幼虫和棉铃虫幼虫 ?