论文部分内容阅读
化疗在骨肉瘤治疗中发挥了重要作用,但是该方法总体有效率为60%左右。目前骨肉瘤新辅助化疗的药物为顺铂(CDDP),阿霉素(ADM),甲氨蝶呤(MTX)和异环磷酰胺(IFO)。顺铂是目前广泛应用抗肿瘤药物之一。伴随着治疗过程的延长,骨肉瘤细胞会产生药物抗性,导致治疗的失败。顺铂耐药已经成为骨肉瘤治疗过程中的一个非常棘手的问题。耐药产生的机制十分复杂,至今仍未完全阐明。骨肉瘤对化疗药物的抗性是其治疗难点。最近,越来越多证据表明长非编码RNA(lncRNAs)在肿瘤发生中发挥至关重要的作用。但参与调控骨肉瘤化疗药物抗性的lncRNAs尚未见报道。因此,我们对lncRNAs是否调控顺铂诱导骨肉瘤凋亡,如何影响药物抗性进行研究。在本研究中,我们发现在顺铂药物诱导骨肉瘤细胞凋亡的过程中,LINC00161被激活且表达上调,并证明高表达的LINC00161可以促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡。在药物抗性产生过程中,由于LINC00161的表达被抑制导致骨肉瘤细胞产生药物抗性而凋亡减少。对LINC00161如何调控骨肉瘤凋亡及药物抗性的机制进一步研究结果表明:LINC00161可以吸附内源的miR-645并且抑制其活性,进而增加骨肉瘤细胞中IFIT2表达,IFIT2蛋白可直接导致细胞凋亡。证明其机制为LINC00161通过调控miR-645-IFIT2信号通路促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡,降低顺铂抗性。因此,这些研究结果表明LINC00161是顺铂诱导骨肉瘤凋亡的重要调控因素,LINC00161-miR-645-IFIT2轴在降低骨肉瘤药物抗性中发挥重要作用。通过本研究,LINC00161可作为骨肉瘤耐药的一种生物标志物,而且还可以作为骨肉瘤治疗的靶点,这些有助于对顺铂治疗骨肉瘤及减小药物抗性提供新思路。实验一LINC00161调控顺铂诱导骨肉瘤细胞的凋亡目的:研究LINC00161在顺铂诱导骨肉瘤凋亡中的作用方法:通过RNA芯片技术筛选顺铂诱导骨肉瘤凋亡的目标Lnc RNAs。验证芯片检测结果,利用q-RT-PCR与Western Blot分析检测顺铂处理不同时间(0、6h、12h、24h)及不同剂量(0μΜ,5μΜ,10μΜ)骨肉瘤细胞内LINC00161的mRNA表达水平差异,凋亡标记物的表达差异。同样方法检测MG-63细胞系内LINC00161的表达情况。为了进一步明确LINC00161在顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用,在骨肉瘤细胞内通过转染敲低LINC00161表达,另一方面使LINC00161过表达,q-RT-PCR和Western Bolt检测顺铂处理24h后凋亡变化。结果:Western Blot结果显示随着顺铂处理剂量(0μΜ,5μΜ,10μΜ)与时间(0、6h、12h、24h)的增加,骨肉瘤细胞凋亡标记物PARP及Cleaved-PARP表达增加。q-RT-PCR检测结果显示随着顺铂处理不同时间(0、6h、12h、24h)以及不同剂量(0μΜ,5μΜ,10μΜ)的增加,骨肉瘤细胞内LINC00161的mRNA水平表达上调。敲低和过表达LINC00161后,Q-RT-PCR和Western Bolt、Annexin V和PI双染流式检测结果显示骨肉瘤细胞中LINC00161敲低后凋亡减少,LINC00161过表达后凋亡增加。结论:1.在顺铂诱导骨肉瘤凋亡的过程中,LINC00161的表达和凋亡存在正相关。2.LINC00161对顺铂诱导骨肉瘤凋亡有促进作用。实验二LINC00161通过调控IFIT2抑制骨肉瘤细胞药物抗性目的:研究LINC00161通过靶蛋白IFIT2参与调控骨肉瘤细胞药物抗性及细胞凋亡。方法:构建顺铂耐药细胞株(U2OSR),利用U2OSR为对照,通过转染使U2OSR中LINC00161表达上调,q-RT-PCR和Western Blot检测骨肉瘤细胞LINC00161表达差异与凋亡相关标志物PARP及casepase-3差异。进行Annexin V和PI双染流式、细胞克隆形成实验检测两组细胞凋亡差异。iTRAQ检测与LINC00161作用相关性最强的靶蛋白-IFIT2,Western Blot分别从顺铂处理不同时间和不同剂量两方面进行验证。证明IFIT2蛋白是受LINC00161调控,分别对骨肉瘤细胞内LINC00161敲低和过表达,RT-PCR检测IFIT2 mRNA变化,Western Blot检测IFIT2蛋白表达变化。结果:耐药株U2SR对顺铂处理产生药物抗性。耐药株(U2OSR)中转染外源性LINC00161后,可以使LINC00161表达上调,再次用顺铂处理后,耐药株顺铂的药物抗性降低,凋亡增加。RT-PCR显示IFIT2的mRNA未变化。Western Blot显示随着顺铂药物处理U2OS时间与剂量的增加,IFIT2蛋白的表达也随之升高并且发现,顺铂药物处理后的骨肉瘤细胞系(U2OS、MG63)中IFIT2蛋白表达的升高与LINC00161表达水平密切相关。LINC00161通过上调U2OS/U2OSR中IFIT2的表达促进并调控药物介导的肿瘤细胞凋亡;并且,抑制U2OS/U2OSR内源性IFIT2的表达直接阻断了顺铂对U2OS/U2OSR凋亡的诱导。结论:1.骨肉瘤细胞系耐药株中LINC00161的低表达使骨肉瘤细胞对顺铂产生耐药性即药物抗性。2.LINC00161调控了IFIT2蛋白的表达,且LINC00161、IFIT2的表达水平与顺铂介导的U2OS/U2OSR凋亡密切相关。3 LINC00161作用机制不影响IFIT2的mRNA水平变化。实验三LINC00161通过miR-645-IFIT2轴影响骨肉瘤细胞的药物抗性并调控药物介导的凋亡目的:研究LINC00161通过调控IFIT2蛋白表达影响骨肉瘤凋亡及药物抗性的机制方法:用Ago2(Argonaute蛋白)抗体形成免疫沉淀蛋白,RT-PCR检测Ago2沉淀中LINC00161表达变化。荧光素酶报告基因分析及验证LINC00161和miR-645表达相关性,检测LINC00161是否通过竞争性结合miR-645促进IFIT2的表达。在U2OS及U2OSR中通过Western Blot对LINC00161、miR-645及IFIT2的表达相关性进行蛋白水平的检测,分析LINC00161调控顺铂诱导U2OS的凋亡及药物抗性的机制。结果:LINC00161具有类似ceRNA角色的功能,出现在Ago2复合物中,可以通过竞争性地结合miR-645。荧光素酶报告基因分析及验证实验证明miR-645可以结合在LINC00161上,Western Blot结果说明下调miR-645表达可以增强U2OS的凋亡,上调则抑制凋亡。过表达的IFIT2可以被过表达的miR-645抵消。过表达的LINC00161促进细胞凋亡的机制是通过抑制miR-645调控的。LINC00161通过竞争性结合miR-645,从而使miR-645失去对IFIT2的mRNA水平的抑制作用,最终促进IFIT2蛋白的表达并减小顺铂的耐药性。结论:1.LINC00161具有类似ceRNA角色的功能,可以竞争性地结合miR-645。2.LINC00161通过调控miR-645-IFIT2轴影响U2OS细胞凋亡及药物抗性。