骨移植手术是临床中仅次于输血的常见组织移植术,各种原因造成的骨缺损的修复是骨科医生所需要面对的一个难题。有研究表明,大于6×6×10mm~3的骨缺损即需要骨移植修复;另外,随着对疾病认识程度的加深外科技术的发展,脊柱外科、神经外科等对骨移植的需求越来越大。骨移植材料可分为自体骨移植、异体骨移植和合成骨替代材料三大类。目前全球已用于临床和尚处于临床前期研究的骨移植材料品种繁多,随着纳米医学的飞速发展,纳米骨移植材料的研究已呈迅猛的发展的态势。本研究就纳米脱钙骨基质的制备工艺、相关生物学检测及融合实验进行探索,为纳米DBM作为一种新的骨移植替代物及骨生长因子载体进一步在临床推广应用提供理论基础。研究目的1.人同种异体脱钙骨基质的制备、相关检测及家兔脊柱融合实验,为脱钙骨基质的纳米化作准备。2.人同种异体脱钙骨基质纳米工艺的探索、研究及纳米DBM的相关检测。3.行纳米脱钙骨基质家兔腰后路椎板间融合实验,研究观察植骨融合效果。材料和方法1.采用手术时切除下来人同种异体骨(除外肿瘤、感染及各类传染性疾病),剔除骨膜和所有软组织,将异体骨劈成骨条,刮除骨髓。用无菌净化水反复冲洗,无水乙醇脱水2h,乙醚脱脂1h后通风处过夜干燥,置-80℃冰箱冻干备用。采用改良Urist法制备脱钙骨基质:1、无水乙醇浸泡2小时;2、去乙醇加乙醚浸泡1小时;3、蒸馏水反复冲洗3次,去尽乙醚;4、0.6N盐酸浸泡72小时,每12小时更换盐酸溶液,浸泡过程中不断搅拌,充分脱钙;5、蒸馏水冲洗3～5次后用蒸馏水浸泡过夜,充分去除骨块内的盐酸;6、无水乙醇浸泡2小时;7、去除乙醇后乙醚浸泡1小时;8、通风处过夜干燥;9、得到脱钙骨基质,抽空分装。通过急性毒性试验、热原实验、溶血试验检测DBM的免疫特性。2.取部分制备的同种异体脱钙骨基质,用液氮冷冻球磨机对脱钙骨基质进行预粉碎。再由日本产MICROS超细湿式研磨粉碎机对脱钙骨基质粉末进行超细粉碎,离心后取得糊状脱钙骨基质超细粉末。将所得样品塑形后置于37℃真空恒温干燥箱干燥。分别取DBM液氮冷冻球磨粉末及MICROS超细粉碎样品进行电镜扫描观察。通过急性毒性试验、热原实验、溶血试验检测纳米DBM的免疫特性。3.行家兔腰椎后路椎板间植骨融合试验,观察融合情况。对实验动物进行分组,A组:单纯DBM移植;B组:纳米DBM移植;C组:自体骨移植;影像学及组织学观察各组动物的腰椎融合状况。研究结果1.制备脱钙骨基质标本。急性毒性实验显示所有实验动物均未死亡,无瘫痪、呼吸抑制等反应,进食、活动、反应等一般情况良好。热原实验示各实验兔体温升高均在0.5℃以下,符合热原检测规定,说明材料无致热作用。溶血试验示体外新鲜兔血溶血率为3.76%,在允许范围内(3%～5%)。2.DBM液氮冷冻球磨粉末样品扫描电镜显示DBM颗粒直径在200～600nm。MICROS超细粉碎DBM样品电镜扫描示颗粒直径在50～200nm,进行塑形干燥后成条块状。急性毒性实验显示所有实验动物均未死亡,无瘫痪、呼吸抑制等反应,进食、活动、反应等一般情况良好。热原实验示各实验兔体温升高均在0.5℃以下,符合热原检测规定,说明材料无致热作用。溶血试验示体外新鲜兔血溶血率为3.31%,在允许范围内。3.所有家兔均耐受手术,无家兔死于麻醉并发症,术后无家兔瘫痪,切口均无感染,无移植物排出。术后影像学及组织学观察显示各组家兔腰椎椎板间不同程度融合。结论纳米DBM是一种无毒、无刺激,不含热源、不引起免疫排斥反应的生物材料,具有良好生物相容性和有效的成骨诱导能力,是脊柱融合自体骨移植的良好替代物。