研究背景：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常见的类型。RCHOP方案能使50%—60%DLBCL患者获得的长期缓解。但是,仍有40%的患者初始化疗后复发且产生耐药,并最终死于原发疾病。目前仍需探索新的药物和方法来增加DLBCL治疗的有效性。细胞凋亡信号传导的缺陷与DLBCL对化疗药物的耐药和复发相关,激活外源性凋亡通路是很多抗肿瘤药物研发和克服耐药的靶向之一。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)是一个强有力的抗肿瘤蛋白。它能诱导包括淋巴瘤、急性白血病和多发性骨髓瘤等在内的多种肿瘤细胞凋亡,但不诱导正常细胞凋亡,因此具有被开发成抗肿瘤药物的可能性。目前几个临床前研究显示以TRAIL单药为基础方案治疗淋巴瘤只有中等程度抗肿瘤活性。提示TRAIL在淋巴瘤治疗的应用过程中存在一定耐药性。TRAIL耐药性的产生可能和以下机制相关,如TRAIL受体的改变、活性氧簇(ROS)产生过多,细胞Fas-相关性死亡结构域样白介素-1β转换酶抑制蛋白(c-FLIP)过度表达,Bcl-2家族蛋白表达异常以及P53基因突变等,而TRAIL受体改变是其主要耐药机制。为了增强TRAIL的作用,联合使用各种自然提取或合成的化合物来增加TRAIL的敏感性是一有效的选择。目前发现像黄芩素、水飞蓟素等很多自然提取物能上调死亡受体(DR)表达,增强TRAIL诱导凋亡作用和抗肿瘤能力。Vernodalol (Vern),中文可译为斑鸠菊醇,其为驱虫斑鸠菊、扁桃斑鸠菊等植物提取出来一种倍半萜内酯类化合物。Vern及其类似物被报道具有抗真菌、抗微生物以及一定抗肿瘤活性。我们推测Vern可能具有增强TRAIL抗淋巴瘤作用,目前未见相关实验研究报道。本研究以DLBCL细胞株为研究对象,阐明Vern是否有抗淋巴瘤作用以及能否增强TRAIL抗淋巴瘤作用,并探究其潜在作用机制,为淋巴瘤的治疗提供新的策略及理论依据。研究目的：1.以DLBCL细胞株为研究对象,明确Vern的是否存在抗淋巴瘤活性以及其能否增强TRAIL抗淋巴瘤作用。2.探究DR5和DR4在Vern增强TRAIL诱导DLBCL细胞株细胞凋亡时的作用。3.探究Vern是否以CHOP依赖模式增加DLBCL细胞株细胞DR5蛋白表达水平,以及CHOP在Vern增强TRAIL诱导DLBCL细胞株细胞凋亡时的作用。4.探究MAPKs信号途径在Vern增强TRAIL诱导DLBCL细胞株细胞凋亡时的作用。5.探究凋亡相关蛋白在Vern增强TRAIL诱导DLBCL细胞株细胞凋亡时的作用。6.在BALB/c裸鼠模型中评价Vern是否能增强TRAIL抗DLBCL细胞株细胞作用。研究方法：1.不同浓度Vern联合不同浓度TRAIL作用DLBCL细胞株Sudhl2、Sudhl4和Sudh110细胞后,通过MTT方法测定细胞增殖力,流式细胞仪(FCM)AnnexinV/PI方法检测细胞凋亡以及Western blot方法检测caspase激活情况。2. Vern作用Sudhl2细胞后,通过Western blot、FCM和real-time PCR等方法检测DR4和DR5的蛋白,mRNA和表面受体表达变化情况；利用siRNA沉默DR4和DR5基因,用MTT和FCM Annexin V/PI方法分别检测Vern、TRAIL以及两者联合作用对Sudhl2细胞增殖和凋亡的影响。3.通过Western blot和real-time PCR检测不同浓度Vern作用Sudhl2细胞后CHOP蛋白和mRNA表达水平变化；分别用转录和转译抑制剂干预后,Western blot检测Vern对CHOP蛋白表达水平变化；siRNA沉默CHOP基因后用Western blot检测DR5和DR4蛋白表达水平变化；siRNA沉默CHOP基因后用MTT和FCMAnnexin V/PI方法检测Vern、TRAIL以及两者联合作用对Sudhl2细胞增殖和凋亡的影响。4. Vern作用Sudhl2细胞后,Western blot方法检测p-ERK1/2、ERK1、p-JNK、 JNK、p-P38和P38蛋白表达水平变化；p38抑制剂(SB202190)、JNK抑制剂(SP600125)和ERK1/2抑制剂(PD98059)预处理Sudhl2细胞后,Western-blot检测Vern对Sudhl2细胞CHOP和DR5蛋白表达水平影响。5. Vern作用Sudhl2细胞后,Westernblot方法检测各种抗凋亡和促凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bad、Bak、Bax、Bid、XIAP、Survivin)蛋白表达水平变化；通过质粒转染的方法,使Sudhl2细胞过表达Mcl-1蛋白,用MTT和FCMAnnexin V/PI方法检测Vern、TRAIL以及两者联合作用对Sudhl2细胞增殖和凋亡的影响；siRNA沉默Sudhl2细胞Mcl-1基因,用MTT和FCM Annexin V/PI方法检测TRAIL对细胞凋亡和增殖的影响。6.在BALB/c裸鼠模型中,皮下注射Sudhl2细胞,待肿瘤直径到3mm-5mm后,瘤体周边分别注射Vern、TRAIL以及两者联合注射,观察肿瘤体积、重量变化以及小鼠体重变化。研究结果：1. Vern联合TRAIL能明显抑制DLBCL细胞株Sudhl2、Sudhl4和Sudhl10细胞增殖,并能增强TRAIL诱导Sudhl2细胞凋亡作用。不同浓度Vern(0μM、10μM、20μM和40州)联合不同浓度TRAIL (0ng/ml、 5 ng/ml、10 ng/ml和25 ng/ml)作用DLBCL细胞株Sudhl2、Sudhl4和Sudh110细胞24h后,MTT方法检测细胞抑制率变化,结果发现,低于201.tM浓度的Vernj邑药不能抑制细胞增殖,401aM有轻度抑制细胞增殖作用；TRAIL单药在5ng/ml-25ng/ml浓度范围以浓度依赖性抑制细胞增殖,但为中等程度抑制；Vern联合TRAIL能够显著抑制DLBCL细胞株细胞增殖,CI小于1说明两者有协同作用。20μM Vern和20 ng/ml TRAIL分别作用Sudhl2细胞24h后,FCM AnnexinV/PI方法检测细胞凋亡,结果发现,只能诱导5%和10%左右的凋亡,两者联合凋亡率增加到30%左右；同时Western blot检测到两者联合作用能激活caspase3, caspase 8以及诱导PARP剪切。2. Vern通过上调DR5蛋白表达来增强TRAIL诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖作用。不同浓度Vern (0μM、5μM、10μM和20μM)作用Sudhl2细胞24h后,用Western blot方法检测,结果发现,Vern以剂量依赖模式增加DR5蛋白表达,而不影响DR4蛋白表达。20μM Vern处理Sudhl2细胞24h后,用FCM检测发现,细胞表面DR5表达上调而DR4表达无变化。不同浓度Vern (0μM、5μM、10μM和20μM)处理Sudhl2细胞24h后,用real-time PCR方法检测发现,随着Vern作用浓度升高DR5 mRNA表达水平逐渐上调,且呈剂量依赖性,而DR4mRNA表达水平则不受影响。分别以Vern (20μM)、TRAIL (20ng/ml)以及两者联合作用DMSO培养基组、DR5 siRNA组和、DR4 siRNA组以及Scramble siRNA组Sudhl2细胞,用MTT检测细胞活性以及FCM Annexin V/PI方法检测细胞凋亡,结果发现,siRNA沉默DR5基因能阻断Vern增加TRAIL诱导细胞凋亡和抑制增殖作用,而DR4基因被siRNA沉默不能阻断上述作用。3. Vern以CHOP依赖模式增加Sudhl2细胞DR5蛋白表达水平。不同浓度Vern (0μM、5μM、10μM和20μM)作用Sudhl2细胞24h,通过Westernblot和realtimePCR方法检测,结果发现,随着Vern作用浓度增加CHOP蛋白表达和mRNA表达水平均逐渐上调,并且呈剂量依赖性。预先用10mM放线霉素D (ACT)和放线(菌)酮(CHX)处理Sudhl2细胞株细胞1h,然后用201μMVern作用Sudhl2细胞24h,再用Westernblot检测CHOP蛋白表达水平变化,发现ACT和CHX能在转录和转译水平分别抑制Vern诱导的CHOP蛋白表达。利用siRNA沉默CHOP基因后,用Westernblot检测,结果发现Vern(20μM)诱导Sudhl2细胞DR5表达上调作用被明显抑制；分别以Vern (20μM)、TRAIL (20ng/ml)以及两者联合作用DMSO培养基组、CHOP siRNA组和Scramble siRNA组Sudhl2细胞24h,然后用FCM Annexin V/PI和MTT方法检测,结果发现,CHOP siRNA组Vern增强TRAIL诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖作用明显被减弱,而其他两组观察不到Vern增强TRAIL上述作用被减弱。4. Vern通过介导JNK磷酸化激活诱导CHOP和DR5表达上调。20μM Vern作用Sudhl2细胞Oh、0.5h、2h和6h后,Western blot检测p-ERK1/2, ERK1、p-JNK、JNK、p-P38和P38蛋白表达水平,结果发现,ERK和JNK被磷酸化激活,而P38没有被磷酸化激活。预先用p38抑制剂(SB202190)、JNK抑制剂(SP600125)和ERK1/2抑制剂(PD98059)作用Sudhl2细胞1h,然后用Vern(20μM)处理Sudhl2细胞24h, Western blot检测CHOP和DR5蛋白表达水平,结果发现JNK磷酸化抑制剂SP600125能以剂量依赖模式抑制CHOP和DR5蛋白表达,而ERK1磷酸化抑制剂PD98059和p38磷酸化抑制剂SB202190对CHOP和DR5蛋白表达水平无影响。5.下调Mcl-1表达与Vern增强TRAIL诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖作用相关。不同浓度Vern(0μM、5μM、10μM和20μM)作用Sudh12细胞24h后,Western blot检测各种抗凋亡和促凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-x1、Mcl-1、Bad、Bak、Bax、Bid、 XIAP、Survivin)表达变化,结果发现,Bad蛋白表达有轻微上调,Bcl-2表达有轻微下调,Mcl-1蛋白表达被明显抑制,且呈剂量依赖性。Sudhl2细胞转入过表达Mcl-1质粒,然后分别以Vern (20μM)、TRAIL(20ng/ml)以及两者联合作用Sudhl2细胞24h, FCM Annexin V/PI方法检测细胞凋亡,MTT检测细胞抑制率,结果发现,Mcl-1蛋白过表达可以明显减弱Vern增强TRAIL诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖作用。Sudhl2细胞转入scramble siRNA或Mcl-1 siRNA,进一步用TRAIL (20 ng/ml)作用细胞24h, FCM Annexin V/PI和MTT方法检测,发现Mcl-1基因被siRNA沉默后,TRAIL诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖作用明显增强,且能明显诱导PRAP剪切。6.在BALB/c裸鼠体内DLBCL模型中Vern同样能增强TRAIL对DLBCL细胞株细胞毒作用。在BALB/c裸鼠中,皮下注射Sudhl2细胞,待肿瘤直径到3mm-5mm后,瘤体周边分别以生理盐水、Vern (2mg/kg)、TRAIL (2mg/kg)和两者联合注射,每3天一次,总共8次,结果显示,Vern (2mg/kg)、TRAIL (2mg/kg)一定程度抑制Sudhl2细胞在BALB/c裸鼠体内成瘤,联合用药组能明显抑制Sudhl2细胞在BALB/c裸鼠体内成瘤且不明显减少小鼠体重。结论：1. Vern能增强TRAIL诱导DLBCL细胞株细胞凋亡和抑制细胞增殖作用。2. Vern增强TRAIL诱导Sudhl2细胞凋亡作用和抑制细胞增殖作用是通过下调Mcl-1表达和上调DR 5的表达来实现,并且依赖于JNK的激活和CHOP的表达。3. Vern联合TRAIL能明显抑制Sudhl2细胞在BALB/c裸鼠中成瘤,且有一定安全性。