【摘 要】
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核酸扩增检测技术是利用不同扩增方法对核酸分子进行多次复制,通过检测扩增产物来实现高灵敏度、高特异性检测的一种分子检测技术。PCR作为核酸扩增技术的典型代表,具有灵敏度高、特异性高、技术成熟和应用广泛等特点,但因其需要包括变性、退火、延伸三个反应阶段的复杂热循环过程,往往需要依靠精密仪器在医院或医学检验中心进行,不利于在基层医疗机构推广应用。等温扩增技术是近年发展起来的一类核酸扩增技术,与PCR技术
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核酸扩增检测技术是利用不同扩增方法对核酸分子进行多次复制,通过检测扩增产物来实现高灵敏度、高特异性检测的一种分子检测技术。PCR作为核酸扩增技术的典型代表,具有灵敏度高、特异性高、技术成熟和应用广泛等特点,但因其需要包括变性、退火、延伸三个反应阶段的复杂热循环过程,往往需要依靠精密仪器在医院或医学检验中心进行,不利于在基层医疗机构推广应用。等温扩增技术是近年发展起来的一类核酸扩增技术,与PCR技术相比,其只需保持恒温条件即可完成扩增反应,因此系统复杂度及操作繁琐性显著降低。本文结合微流控芯片技术与核酸等温扩增技术,研究了基于微阵列芯片的数字重组酶聚合酶扩增（digital RPA）核酸绝对定量检测方法,建立了数字RPA扩增检测系统,可在30分钟左右实现进样与数字RPA扩增反应。本文的主要内容如下:首先,研究并实现了一种可用于粘稠试剂进样的数字等温扩增的微阵列芯片及其检测平台。通过对PDMS改性、提高芯片内部真空度等方式,实现了粘稠度较高的RPA试剂在高密度微阵列芯片中的快速进样;通过密封油与载玻片的折射率匹配,降低了光信号在通过玻璃及矿物油时的强度损失;此外,综合使用真空气相沉积与密封隔绝的方式,提升了芯片气密性,防止试剂蒸发;同时,搭建了一个微流控芯片检测平台,用于微流控芯片的流体控制及过程监控等。其次,基于所提出的微阵列芯片,研究并实现了数字等温扩增检测系统。该系统由检测模块与扩增模块两部分组成,检测模块的光源经波束整形光路后发散角较小,能够提供直径约40mm的圆形均匀光斑;同时还重点研究了在不同光源照射方式下荧光图像的成像效果,尤其是重点研究了效果较优的同轴落射照明方式;扩增加热部分采用半导体制冷器配合改进后的PID温度控制算法,以满足快速升温和精准控制的要求。最后,针对数字等温扩增检测系统获取到的荧光图像,提出了包含预处理、微井寻址定位、荧光强度提取等步骤的荧光图像处理算法,滤除了各类噪声,提高了微井信号区域与背景的对比度,并使用参数区域优化的霍夫圆算法成功分割了背景与微井区域,在经灰度筛选后,得到了有效的阳性微井数量,由此实现了初步的数字等温扩增检测。
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