[目的]探讨我国慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的临床特征及主要实验室特征,在传统临床分期的基础上评价细胞遗传学异常、免疫球蛋白重链可变区(IGHV)突变状态等综合因素对CLL患者疾病进展的影响,建立新型的针对CLL患者治疗间隔时间(TTFT)的预后积分系统,用以预测疾病早期的进展风险。进一步探讨伴染色体17p缺失(17p-)患者的预后因素。探讨不同治疗方案对我国慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的治疗反应和长期疗效。[方法]回顾性分析我院自1998年10月至2015年2月间503例CLL患者的临床及实验室检查资料。分析其临床特征及实验室检查特征对预后的影响,应用χ2检验进行差异性检验,并利用Log-rank法检验各组患者生存率的差异,并建立Cox回归模型在其中筛选出影响TTFT的独立预后因素,后在173例患者中进行验证,并比较不同治疗方案的疗效。[结果]1、临床特征:中位发病年龄58(26-86)岁,男性:女性比例为1.99;初诊时临床分期以Binet A期为主,为204例(40.5%),其次为Binet C期和B期,分别为151例(30.1%)和148例(29.3%);初诊时108例(21.1%)贫血[血红蛋白(HGB)<100g/L],427例进行乳酸脱氢酶(LDH)检测的患者中,有113例(26.5%)患者LDH升高,344例进行CD38检测的患者中共计100例(29.1%)的患者可检测到CD38的表达。330例具有完整荧光原位杂交(FISH)资料的患者中,156例(47.3%)的患者伴13q缺失(13q-),为检出率最高的细胞遗传学异常;其次为IgH易位[t(IgH),22.4%],12 号染色体三体(+12,21.2%)和 17p-(14.5%)。在 230例进行IGHV突变状态检测的患者中,165例患者IGHV为突变状态(71.7%),表达V4-34基因的患者比例最高,占12.4%(28例)。中位无进展生存期(PFS)为89.0(95%CI 75.0-103.0)个月,中位总生存期(OS)为 129.0(95%CI 106.9-151.1)个月;2、遗传学异常与预后:伴有17p-的CLL患者(17p-CLL)总体反应(OR)率为56.9%,而17p高比例缺失(定义为≥25%)者OR率更低。17p-CLL患者中位OS为78.0(95%CI,55.6-100.4)个月,较17p-阴性患者显著缩短(中位OS 162.0个月,95%CI 92.2-231.8 个月,P<0.001)。在 17p-CLL 患者中,Binet B-C 期、LDH、伴B症状、IGHV为未突变状态及17p缺失比例在25%以上者PFS显著缩短,其中LDH水平升高为17p-CLL患者PFS的独立预后不良因素;3、TTFT预后积分系统:我们通过建立Cox回归模型,利用多因素分析发现Rai分期中高危组、17p-及IGHV未突变状态是影响CLL患者TTFT的独立预后因素,将以上因素按照风险比进行权重积分,积分和即为CLL预后积分系统(CLL-PI),验证组173例患者按照CLL-PI被分为四个危险组:低危组(CLL-PI 0分)、中低危组(CLL-PI 1分)、中高危组(CLL-PI 2分)及高危组(CLL-PI 3-6分),四组患者中位TTFT分别为未达到、65.0个月、36.0个月及19.0个月(P<0.001);4、利妥昔单抗联合化疗的疗效分析:一线采用含利妥昔单抗方案治疗的患者为72例(43.6%);未用利妥昔单抗治疗的患者为93例(56.4%)。利妥昔单抗治疗组完全缓解(CR)率和OR率均显著高于未应用利妥昔单抗治疗组(38.9%vs.21.5%,P=0.015;83.3%vs.60.2%,P=0.001);一线治疗获得CR的患者中位PFS及中位OS均较未达CR的患者显著延长(P<0.01)。利妥昔单抗治疗组中位PFS为53.0(95%CI 27.0-79.0)个月,中位OS为112.0(95%CI 81.1-142.9)个月,均较未应用利妥昔单抗组(PFS 28.0个月,95%CI 18.3-37.7;OS 89.0个月,95%CI 72.0-106.0)延长,但两组间无显著性差异。按照是否伴有高危遗传学因素(染色体17p-或11q-)将患者分组,高危组应用利妥昔单抗治疗可显著提高OR率,但PFS及OS无明显优势;而在非高危组中,应用利妥昔单抗治疗的患者PFS显著延长(P=0.05)。[结论]与欧美国家相比,本组CLL患者发病年龄偏轻,总体生存率和生存期与欧美国家相近,一定程度上反映了我国CLL的特点。17p-CLL虽然病程相对侵袭,但仍具有一定异质性,LDH作为应用普遍的血清学指标可在一定程度上影响17p-CLL患者预后。在传统分期基础上整合遗传学预后因素的CLL-PI积分系统(危险因素包括Rai分期中高危组、17p-及IGHV未突变型)可以有效划分具有不同进展风险的危险组,用于预测CLL患者TTFT。而利妥昔单抗联合化疗的方案治疗CLL可获得更高的CR率、OR率,明显优于单纯化疗的方案,对不伴高危遗传学因素的患者,还可以显著延长PFS。一线治疗获得CR的患者PFS和OS更长。[目的]在CLL微环境中,间充质干细胞、单核细胞等可支持CLL细胞的生存,部分CLL患者存在免疫异常。程序性死亡受体-1(Programmed death-1,PD-1)及其配体,Programmed death-Ligand1,PD-L1)组成的 PD-1/PD-L1 通路可一方面促进CLL细胞增殖,并同时抑制效应性T细胞的抗肿瘤免疫功能。本研究旨在研究CLL微环境中PD-1、PD-L1分子的表达水平及临床意义,并证实抑制PD-1/PD-L1通路对逆转CLL免疫抑制状态的作用。[方法]研究主要应用流式细胞术检测初诊、进展、复发CLL患者外周血免疫效应细胞表面PD-1分子的表达水平,肿瘤细胞及单核细胞表面PD-L1分子的表达水平。之后应用磁珠分选技术分离CLL患者原代T细胞、单核细胞及肿瘤细胞,在培养体系中加入PD-L1及PD-1单克隆抗体,或联合应用来那度胺(Len),并检测细胞表型变化及T细胞免疫功能。[结果]与年龄匹配的正常供者相比,CLL患者的外周血CD4+/CD8+T细胞比值显著降低(1.53±1.34vs.3.55±5.11,P=0.018)。以 CD4+/CD8+T 细胞比值≤1 为比例倒置,13例(32.5%)CLL患者存在CD4+/CD8+T细胞比例倒置。应用流式细胞术检测了 CLL患者T细胞亚群,结果显示,相较于正常对照,CLL患者CD4+童贞T细胞(TNaive)细胞亚群及CD8+TNaive细胞亚群比例均显著低于正常人(P<0.001);CD4+效应性记忆T细胞(Tcm)细胞亚群及CD8+ Temm细胞亚群比例均显著高于正常人(P<0.001);而中央性记忆T细胞(Tcm)及终末分化的效应性T细胞(Teff)与正常对照无显著差异。另外,进展/复发的CLL患者CD4+TNaive细胞亚群及CD4+Tem细胞亚群均与初诊(ND)CLL患者有显著差异(P<0.001),BinetB-C期患者CD8+ Tem细胞亚群比例较Binet A期患者显著升高(P=0.026)。CLL患者外周血Treg细胞比例显著高于正常对照(P=0.0077),且Treg比例升高趋势在进展/复发CLL患者以及Binet分期B-C期CLL患者中更为显著。而CD38表达阳性的CLL患者外周血Treg比例为9.1±6.0%,显著高于CD38表达阴性的CLL患者(5.7±3.7%,P=0.049)。患者 CD4+ T 细胞中 31.7± 15.4%表达 PD-1 分子,CD8+ T 细胞中 18.8±13.4%表达PD-1,Treg细胞中24.7±15.2%表达PD-1,均显著高于正常人(CD4+T细胞 17.0±8.0%,CD8+T 细胞 10.6±7.2%,Treg 14.5±7.0%,P<0.001),并且CD4+T细胞分化亚群表面PD-1表达水平也均显著高于正常对照(TNaive:7.5±10.7%vs.1.2±0.8%;Tcm:22.3±15.0%vs.13.6±8.2%;Tem:43.0±15.1%vs.34.1±9.1%;Teff:21.8±17.8%vs.11.1±10.4%均显著高于正常对照,P<0.01)。虽然CLL细胞表面PD-L1分子表达水平相较于正常人无显著性差异,但PD-1分子表达水平显著增高(P<0.01),并且患者CD11b+单核细胞表面PD-L1水平较正常对照显著高表达(P=0.0034),患者血浆中可溶性PD-L1分子(sPD-L1)表达水平较正常对照血浆显著增高(P=0.0195)。将患者单核细胞(Mo)与同源CLL细胞在体外共培养后,CLL细胞表面PD-L1较未与Mo共培养组升高,而PD-1表达水平则较未共培养组CLL细胞显著降低(P<0.001),同未与Mo共培养的Control组相比,共培养组(+Mo组)CLL细胞增殖活性为Control组1.39±0.14倍(P=0.0391)。而在共培养体系中加入PD-1单抗、PD-L1单抗,或同时联合应用来那度胺(Len),CLL细胞的增殖活性又再次下降,其中以PD-1/PD-L1抑制剂与Len联合用药组最显著,为Control组1.16±0.15倍,较+Mo组显著降低(P=0.0489)。另一方面,将患者单核细胞与T细胞共培养后,CD4+T细胞、CD8+T细胞表面PD-1分子表达水平均较Control组显著升高(P<0.05)。T细胞的增殖活性在与Mo共培养后较对照组明显降低(28.0%vs.86.6%),而在培养体系中加入PD-1单抗阻断PD-1/PD-L1通路后后,T细胞增殖活力较前组明显提高(83.9%vs.28.0%)。患者骨髓单个核细胞在体外用Len预处理后,骨髓CD4+T细胞、CD8+T细胞及NKT细胞表面PD-1分子的表达水平较对照组显著降低(P<0.05),同时,骨髓单核细胞表面PD-L1分子表达水平在用Len预处理后也显著降低(P<0.05),但Len对CLL细胞表面PD-L1分子表达水平的影响并不显著。患者T细胞经PD-1/PD-L1抑制剂联合或不联合Len在体外预处理3天后检测T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,结果显示PD-1/PD-L1抑制剂处理组及Len单药处理组T细胞对CLL细胞的杀伤作用均较对照组显著提高(P<0.05),而Len与PD-1/PD-L1抑制剂联合用药组则差异更为显著(P<0.01),且T细胞所释放的杀伤性细胞因子水平,包括颗粒酶B(GzmmB)、干扰素Y(IFN-y)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在应用Len与PD-1/PD-L1抑制剂预处理后均较对照组显著提高(P<0.05)。[结论]本研究通过对T细胞各亚群比例及功能的研究,证实PD-1/PD-1通路在CLL微环境中起到抑制肿瘤免疫、促进肿瘤增殖的作用,而PD-1/PD-L1通路抑制剂对CLL患者耗竭的T细胞功能具有改善作用,与来那度胺联用后可进一步增强,从而为来那度胺和PD-1/PD-L1单抗联合用药治疗CLL提供理论依据。