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目的和背景： 乙醇是一种亲神经性毒物，也是酒的主要成分。绝大多数乙醇中毒发生于饮酒，乙醇对发育中大脑有严重的损伤作用，但其作用机制尚不清楚。近来的研究大多着重于酒精对成熟动物的慢性作用。美国华盛顿大学医学院Olney博士领导的研究小组发现，在大脑的发育期间，酒精通过阻断NMDA受体和过度激活GABA受体的双重机制，广泛地引起大脑中神经元凋亡。研究发现酒精损伤的作用最敏感的时期正是脑生长发芽(BGS)期，在人类为孕后三个月(相当于大鼠新生至生后两周)，在这个时期，短暂的酒精接触便会使皮质、海马、小脑的上百万神经元损害。临床上表现为该期孕妇一次大量饮酒就可能致胎儿死亡、畸形或生后智力障碍(胎儿酒精综合征，FetalAlcoholSyndrome，FAS)。建立这时期急性酒精中毒的动物模型，有利于我们对人类胎儿酒精综合征(FetalAlcoholSyndrome，FAS)的进一步研究。热休克反应是一切有生命细胞遇短暂高温刺激时发生的一种以基因表达和调控变化为特征的细胞应激反应，其产生的一组蛋白质即热休克蛋白(heat shock protin，HSP)已有文献报道对多种应激情况如中风、神经变性的疾病、癫痫、重金属中毒、氧化应激、感染、创伤和代谢毒物下的细胞有保护作用，而其中最显著的就是热休克蛋白70(HSP70)。应激刺激时HSP70表达的增加指引我们去研究他在诱导耐受中潜在的保护效应。国内外已有研究报道热应 浙江大学硕士学位论文激处理可对抗中毒损伤如暴露在谷氨酸盐中培养的小脑细胞，预先的热休克和亚致死缺血可保护细胞免于其后的脑缺血、缺氧损伤，但有关热预处理能否减少脑发育期急性酒精中毒损伤，研究较少。本实验是从形态学及分子生物学角度来探讨热休克预处理对发育期脑细胞急性酒精中毒损害的影响。 本文通过腹腔注射中毒剂量酒精至生后8、14天SD大鼠，建立急性酒精中毒模型;热休克预处理模型的制备参照Blake模型制备。用HE染色及尼氏特染观察新生大鼠脑细胞基本病理学改变，用脱氧核糖核昔酸末端转移酶介导的dUTp断端标记(terminal一deoxynueleotidyl transferase mediatedd一UTpnick。nd labelling，TuNEL)法检测脑细胞的凋亡，用免疫组化(ABC法)检测HSP7O在脑细胞中的表达，探讨热休克预处理诱导HSP7O蛋白表达对发育期脑细胞酒精中毒损害的影响。方法: 动物分组与处理:选择生后8一14天健康，雄性，一级质量标准的S一D大鼠30只，体重18.4士3.89，随机分为三组:单纯生理盐水组、单纯酒精组、热休克预处理加酒精组，每组10只。单纯酒精组，称重后，以中毒剂量酒精2.59/kg腹腔注射无水酒精溶液(99.7ry0分析纯);热休克预处理加酒精组(参照Blake模型制备法)，用2q0戊巴比妥纳(40mg/kg)腹腔注射麻醉，再放入60℃恒温箱中，肛温达42℃后，持续巧min，取出室温25℃下继续饲养24h后，再予酒精处理，余具体步骤同单纯酒精组;单纯生理盐水组予生理盐水腹腔注射处理。三组经处理后6小时，用2%戊巴比妥(40mg/kg)经腹腔麻醉后经左心室快速灌注4q0多聚甲醛溶液(用P BS配制，pH=7 .4)后，取脑组织并修块，参照《大鼠脑立体定位图谱》取冠状位脑块(视交叉后2一6Inln含海马区)置于4%多聚甲醛溶液中固定24小时，梯度酒精脱水，石 3 浙江大学硕士学位论文蜡包埋，冠状位取5 pm切片，用HE染色和尼氏染色观察脑基本病理学改变，TUNEL法检测细胞凋亡，用免疫组化(ABC法)检测热休克蛋白70在脑内的表达。 统计分析:所有数据以mean士sD表示，用sPssll.0 for windows统计软件包分析处理，两样本资料的比较应用Wilcoxon秩和检验，用Spearman线性相关性分析(以决定系数厂表示相关强度)，以尸<0 .05为统计学上具有显著性差异。结果:一大鼠一般状态观察: 新生SD大鼠给予中毒剂量酒精后，单纯酒精组死亡1只，给予酒精后大鼠相继出现腹式呼吸、运动失调、困倦、正位反射消失等酒精中毒表现。热休克预处理加酒精组大鼠，也可出现类似酒精中毒表现，但该组出现正位反射消失所需时间(7.80士3.08分)比单纯酒精组(3.20士2.25分)长，具有显著的统计学差异(户0.007)，且正位反射恢复所需时间(10.50士 4.33分)较单纯酒精组(17.n士5.35分)短，具有显著的统计学差异(几0.043)。二.大鼠脑组织基本病理学改变: 对各组新生SD大鼠含海马区脑组织切片行病理HE染色，用01ymPuS显微镜观察，发现单纯酒精组大鼠海马齿状回颗粒细胞之间接触减少，排列紊乱，细胞形态不规则;胞膜皱缩;胞浆减少，嗜酸性染色增强，也有的胞浆内出现空泡，细胞浊肿;胞核固缩，深染，核仁消失;神经胶质细胞增多。而单纯生理盐水组及热休克预处理加酒精组海马齿状回颗粒细胞接触紧密，排列整齐，细胞大小匀称、规则;胞膜光滑;胞浆完整，淡染;胞核