水稻矮缩病毒S6、S11功能的研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:habi_jia
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水稻矮缩病毒(Rice Dwarf Virus,RDV)基因组由12条dsRNA组成,其中6个基因编码结构蛋白,6个基因编码非结构蛋白。S6和SS6是运动蛋白,S11是非特异性的核酸结合蛋白,并初步定位了其核酸结合区域,S11还可以通过某种途径进入叶绿体中。对水稻矮缩病毒RDV运动蛋白Pns6的功能研究是通过RDV S6与PVX细胞间运动功能缺陷株的互补实验来进行的。大致方法如下:利用马铃薯X病毒(PVX)细胞间运动缺陷的侵染性载体,将分别带有GUS和GFP基因的PVX cDNA突变体克隆和CaMV 35S-RDV S6克隆都是编码RDV非结构蛋白的。本实验已初步证明过基因枪法分别或共同转入烟草表皮细胞进行表达。结果说明S6编码蛋白能互补PVX突变体的细胞间运动功能,表明Pns6蛋白是RDV的细胞间运动蛋白。从而在国际上首次发现并证明了该类病毒的细胞间运动蛋白。同时也对RDVS6编码蛋白在烟草表皮细胞中的定位进行了研究。已经将水稻矮缩病毒运动蛋白(S6)与EGFP的融合基因克隆到植物瞬间表达载体,在烟草(N.tabacum)的叶片表皮细胞中进行瞬间表达,发现S6编码蛋白在细胞壁的胞间连丝和细胞核中有特异表达,在细胞质中的表达与细胞骨架组成蛋白无关。将健康水稻和RDV感染水稻叶片进行超薄切片和用S6编码蛋白及外壳蛋白特异抗体的免疫胶体金标记分析发现S6编码的运动蛋白特异定位于RDV感染水稻的胞间连丝及细胞质中的病毒复制复合体中,这个结果与绿色荧光蛋白标记的结果相吻合。另外,上述研究还发现在胞间连丝处没有类似RDV颗粒的病毒粒子,暗示RDV可能不是以病毒粒子的形式通过胞间连丝。鉴于对RDVS6、S11基因编码的蛋白的功能还缺乏细致的了解,尤其是它们都属于非结构蛋白,在染病水稻与叶蝉中含量很低,很难纯化,目前最好的方法是用基因工程的方法在真核和原核病毒体系中表达大量病毒RDV蛋白以供研究。本文运用毕赤酵母表达系统,把RDVS6、S11基因克隆到酵母表达载体pPIC9k中成功表达出了Pns6和Pns11蛋白,并通过Western blotting得到证实。与此同时通过水稻cDNA文库的构建,运用酵母双杂交系统,经反复筛选验证,从水稻的基因组文库中钓出4个与S6作用的细胞因子,5个与S11作用的细胞因子,对钓到的基因进行DNA序列测定,大多为3′端的片段,通过5′RACE扩增得到的基因片段的全长,通过BLASTN搜索进行序列比对,找出与其同源性高的基因,并根据已知基因的性质推测所得到的新基因的性质,进一步通过实验来验证是否具有已知基因的性质以及它自身所特有的功能。并且在分子、细胞以及整株水平上进行了系统研究,更深一层了解RDV运动蛋白的作用机理及其与宿主的相互关系,进一步增加对Pns6、Pns11功能的了解。这将对RDV的分子病毒学、RDV与宿主间的相互关系等具有重要的理论价值,并为植物病害防治提供依据。
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