羧肽酶是昆虫体内重要的消化酶系之一,而到目前为止,仅有少量关于昆虫丝氨酸羧肽酶(seine carboxypeptidases,SCP)的描述,家蚕中未见相关研究报道。根据组织器官的差别,丝氨酸羧肽酶所发挥的功能存在差异,从消化食物乃至到合成神经内分泌肽等,都存在有丝氨酸羧肽酶的作用。本实验基于家蚕SAGE文库分析筛选出一个高温与常温表达差异显著基因——丝氨酸羧肽酶基因,并从家蚕5龄幼虫脂肪体中克隆了该基因,对该基因序列进行生物信息学分析,调查了在常、高温条件下,该基因在不同发育阶段的表达规律,进一步分析该基因与卵黄蛋白的关系。获得了以下研究结果:1家蚕丝氨酸羧肽酶(SCP)新基因c DNA的克隆及其分析基于本研究室构建的常、高温条件下家蚕幼虫组织SAGE表达文库,以雌性幼虫高温处理后显著低表达Tag(CATGGTGCCGCGGGACCAGCC)为线索,根据SAGE文库中的注释信息获悉目的基因在家蚕基因组数据(http://www.silkdb.org/silkdb/)中的基因登录号为BGIBMGA012773-TA,使用RACE技术,将其m RNA序列由原来预测到的1416bp延长至1671bp,3’RACE延长了85bp,其中最长ORF 1416 bp。通过构建分子进化树进一步分析,表明家蚕Bm SCP基因与大红斑蝶的EHJ78980.1基因的进化距离最近,形成同一分支,与其他昆虫的SCP在进化关系上相对较远。通过家蚕SCP与脊椎动物以及其他物种中的SCP进行蛋白序列比对分析发现,高等脊椎动物乃至昆虫间SCP的氨基酸残基具有较高保守性,存在较多的氨基酸相似位点,说明该蛋白在漫长的进化过程中保守性较高,并具有较高的种间相似性。5龄3d的幼虫不同组织表达实验与EST表达谱存在差异,Bm SCP基因不仅在脂肪体中表达,而且还在多个组织中均有表达。通过分析初步鉴定该基因为家蚕中未报道过的丝氨酸羧肽酶基因(SCP)。2高温处理对家蚕Bm SCP基因的表达影响及特异性分析分别提取5龄时期常温和高温条件下不同性别不同发育期家蚕的脂肪体和中肠组织m RNA,通过荧光定量PCR的方法,调查在常温和高温处理条件下,不同性别不同组织中Bm SCP基因的表达状况。结果表明,在雌性家蚕5龄幼虫脂肪体中,高温组对比与常温组之间,Bm SCP基因表达有显著差异,而在雄性中仅在5龄5d天时存在显著差异;而在家蚕中肠组织中,与常温组相比,雌性和雄性分别在5龄7d天和5龄3d天存在显著差异。上述结果说明,Bm SCP基因是一个高温敏感基因,并且Bm SCP基因在雌性家蚕脂肪体中的敏感性明显高于雌性中肠、雄性脂肪体和中肠中。无论是常温组还是高温组,Bm SCP基因在家蚕脂肪体的表达存在显著性别差异,也就是说这种性别间差异表达规律与饲育温度没有直接关系。而在家蚕中肠中,Bm SCP基因表达不存在明显的性别差异。推测Bm SCP基因在雌蚕脂肪体中存在一种特殊功能,可能与雌蚕生成卵内所需的营养物质储存和转化相关。不同发育阶段Bm SCP基因组织差异表达分析显示,在雌性家蚕中Bm SCP基因表达存在显著组织差异,发现Bm SCP基因在5龄期中肠中也存在高表达,进一步佐证了Peter等关于丝氨酸羧肽酶在昆虫中肠中存在消化功能的推测,。3家蚕Bm SCP基因与卵黄蛋白的关系家蚕卵从开始成形到产下卵共8d,分析家蚕卵巢、卵中卵黄蛋白(Yolk protein,YP)含量与Bm SCP基因的表达的关系,试验结果显示,YP的波动趋势与Bm SCP基因的表达趋势相一致,推测SCP基因及其相应的酶可能参与YP的合成。同时发现在5龄发育阶段,雌蚕脂肪体中SCP转录与卵黄原蛋白受体(Vitellogenin receptor/yolk protein receptor,Vg R/YPR)基因转录表达趋势一致。推测SCP基因及其相应的酶不仅参与卵黄蛋白的合成,而且还可能参与卵黄蛋白前体的加工修饰,与Vg R基因协同转运卵黄原蛋白(Vitellogenin)。