节杆菌β-呋喃果糖苷酶的制备、纯化及对甜菊糖的改性研究

来源 :华南理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:mzhouliqun
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随着人们对室内环境舒适度要求的不断提高,空气除湿特别在亚热带气候的华南地区显得十分重要。吸湿剂在室内空气湿度调节领域有着广泛的应用。继经历“SARS”(非典型肺炎)后,甲型H1N1流感的流行,人们对室内空气品质的警觉性更加高涨,对高选择性吸湿剂的需求更为迫切。   本文的目的是制备选择性能高的除湿剂。以廉价、高吸湿量的硅胶为载体,首先对其进行活化处理,使用γ-氨丙基三乙氧基硅烷完成氨基改性,然后分别选取草酸、苹果酸、苯乙烯-马来酸酐(SMA)为交联剂,通过交联剂与氨基改性硅胶的酸碱中和反应制备核-壳结构的选择性吸湿剂,并对选择性吸湿剂进行红外光谱表征。最后,测试所制备的吸湿剂对水及甲苯的吸附量,并计算其吸湿选择性。考察硅胶孔结构、交联剂结构对吸湿量及吸湿选择性的影响。测试结果表明,与硅胶相比,所制备的吸湿剂对甲苯吸附量明显降低,而对水蒸气的吸附量略有降低,吸湿选择性较好。在不同结构的硅胶中,C型硅胶为核的吸湿剂的选择性最好,其中,苹果酸改性C型硅胶的选择性最好。   甜菊糖苷,简称甜菊糖(Steviosides),是从菊科植物甜叶菊叶片中提取的高甜度、低热量的天然甜味剂,其甜度相当于蔗糖的200-350倍,热量是蔗糖的200-300分之一,是目前国内外公认的可替代蔗糖的理想的健康新糖源。而甜菊糖的后味及苦味问题限制了其更为广泛的应用。据报道果糖基化的甜菊糖甜味更纯正,无后苦味,可与阿斯巴甜媲美,有比葡糖基化甜菊糖更大应用空间和商业价值,而果糖基化甜菊糖的酶法改质研究在中国还是空白。本研究主要进行发酵节杆菌制备β-呋喃果糖苷酶,并应用此酶进行甜菊糖的改性研究。具体结果如下:   节杆菌产β-呋喃果糖苷酶的最佳碳源为蔗糖,氮源为玉米浆,碳氮摩尔比为10:1。自然生长条件下,节杆菌在对数生长期18h-22.5h之间大量产β-呋喃果糖苷酶。在18h-27.5h期间,pH与β-呋喃果糖苷酶的酶活呈反向变化。含有β-(2,1)糖苷键的果糖残基才可有效诱导β-呋喃果糖苷酶的产生。20%的溶氧浓度是较理想的溶氧浓度控制下限。用80%饱和度的硫酸铵进行一步盐析或分别用40%与80%饱和度的硫酸铵进行分步盐析及超滤浓缩处理,均可对β-呋喃果糖苷酶进行有效的浓缩,且超滤浓缩和80%饱和度硫酸铵一步盐析的酶活回收率均可达90%以上。β-呋喃果糖昔酶冻干粉的稳定性较高,4℃保存6个月后酶活还有88.07%的回收率。   用DEAE-Sepharose Fast Flow纯化节杆菌β-呋喃果糖苷酶,其洗脱方法为:先用0.5 mol/L NaCl,50mmol/L PB(pH7.00)充分洗脱后,再用1mol/L NaCl,50mmol/L PB(pH7.00)洗脱,收集1 mol/L NaCl,50mmol/L PB(pH7.00)的洗脱液即可得到纯的β-呋喃果糖苷酶。β-呋喃果糖苷酶的纯化倍数是18.86,酶活回收率为37.03%,SDS-PAGE结果表明β-呋喃果糖苷酶的大小为约55KDa,其对蔗糖的比活力为19.81U/mg。β-呋喃果糖苷酶的最适pH和温度分别为6.5和40℃,pH和温度稳定范围分别为6.0~8.0和40℃以下。   β-呋喃果糖苷酶对甜菊糖改性的最佳反应条件为:pH为6.5,反应温度为40℃,甜菊苷、莱鲍迪A苷与蔗糖的摩尔比分别为0.0005、0.0012,加酶量15 U/mL,反应时间15h。在此反应条件下,甜菊苷和莱鲍迪A苷的转化率分别为69.4%和72.0%,同时研究表明此酶对甜菊糖苷的sn-19位具有底物特异性。
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