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动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)所致的心、脑血管疾病严重危害人们的健康和生命,其发病率和死亡率均居各种疾病前列,其确切病因至今尚未完全明了,且发病机理十分复杂,在百余年的研究过程中曾提出多个学说,如脂质浸润学说、血栓形成学说、损伤反应学说等。近年来的损伤反应假说已为人们所公认,亦即动脉粥样硬化病变始于内皮损伤。血管内皮细胞层对于血液和组织液成分是一个半通透性屏障,血液内外的物质成分的交换必须首先通过血管内皮细胞层有选择性的来进行,因此,其形态和功能的完整性对于机体保持正常的生理功能至关重要。大量的临床及动物实验证实,血管内皮损伤出现功能障碍是AS的最敏感指标之一。因此,深入研究AS内皮细胞的分子机制,寻找新的拮抗AS的药物具有重要医学意义。褪黑激素(melatonin, MLT)亦称褪黑素,主要是由松果体分泌的一种激素。近年来研究表明,MLT具有降低血脑屏障的通透性,调节血脂代谢与动脉粥样硬化等生理作用。虽然认为MTL对防止AS是有益的,但还需作大量的基础及临床研究工作。本研究在复制高脂血症和糖尿病模型的基础上,探讨肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain MLC kinase MLCK)的表达是否与丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路有关。在此基础上复制AS模型,探讨MLT对AS模型兔动脉内皮细胞MLCK的影响是否通过与MAPK信号转导通路,进而对MLT调节MAPK信号转导通路的分子机制作了初步探讨。目的:研究高脂血症兔动脉内皮细胞和糖尿病大鼠肾脏MLCK的表达是否与MAPK信号转导通路有关。在此基础上进一步分析MLT对AS模型兔动脉内皮细胞MLCK的影响是否通过MAPK信号转导通路,进而探讨MLT调节MAPK信号转导通路的分子机制。方法: (一)高胆固醇饮食诱发兔高脂血症模型,链脲佐菌素诱发大鼠糖尿病模型。Western blot检测胞外信号调节激酶(extracellar signal-regulated kinase ERK)、p38和Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase JNK)磷酸化水平;Western blot与免疫组织化学法检测MLCK蛋白表达水平。(二)高胆固醇饮食诱发兔AS模型,MLT治疗给药(10mg/kg/d,d42-d84)。相关试剂盒检测血脂;Western blot检测MLT对ERK、p38和JNK磷酸化水平;Western blot与免疫组织化学法检测MLCK蛋白表达水平;γ-P32掺入法检测MLCK活性;免疫荧光(大分子染料渗透法)检测动脉内膜通透性。(三)体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)。观察PKC激活剂PMA、MEK抑制剂PD98059,p38抑制剂SB203589,JNK抑制剂SP600125等对氧化型低密度脂蛋白(Oxidative Low Density Lipoprotein,oxLDL)诱导的HUVEC MAPK磷酸化、MLCK的转录、表达、活性以及MLT的作用。MTT法检测oxLDL对HUVEC增殖的影响;Western blot检测MLT对MLCK表达的影响;光学显微镜观察HUVEC形态;Western blot检测ERK、p38、JNK磷酸化水平;RT-PCR检测MLCK mRNA转录;Western blot与免疫组织化学法检测HUVEC MLCK蛋白表达水平;γ-P32掺入法检测HUVEC MLCK活性。结果:1.高脂血症模型兔动脉和DN模型大鼠肾脏MLCK与MAPK成功地建立了高脂血症兔模型和DN大鼠模型;高脂血症模型兔动脉MLCK的表达明显升高,并与MAPK信号转导通路有相关性,糖尿病肾病(diabetes nephoathy,DN)模型大鼠肾脏MLCK的表达明显升高,但与MAPK信号转导通路无明显相关性。2. MLT对AS兔模型动脉MLCK的影响成功复制AS兔模型; MLT能降低AS模型兔血脂水平,降低动脉内膜通透性。AS模型兔动脉在AS形成过程中MAPK相关蛋白磷酸化程度增加,MAPK可能通过磷酸化机制即提高MLCK活性和表达使MLC磷酸化来影响内皮细胞通透性。而MLT通过降低相关蛋白的磷酸化调控MLCK的活性和表达以及动脉内膜通透性。提示MAPK信号通路失调与AS的形成密切相关。3. MLT与PMA对HUVEC MLCK的影响PMA对MLCK的表达具有促进作用,MLT降低MLCK的表达。PMA与MLT共处理时能降低PMA引起的MLCK活性和表达升高,该过程与ERK磷酸化相关。4. MLT与PD98059对HUVEC MLCK的影响PD98059与MLT均抑制MLCK的表达与活性,PD98059与MLT共处理时,在MLCK表达与活性上具有协同效应,该过程与ERK磷酸化相关。5. MLT与SB203580对HUVEC MLCK的影响SB203580与MLT均抑制MLCK的表达与活性,SB203580与MLT共处理时,在MLCK表达与活性上具有协同效应,该过程与p38磷酸化相关。6. MLT与SP600125对HUVEC MLCK的影响SP600125与MLT抑制MLCK的表达与活性,SP600125与MLT共同处理HUVEC时发现其能降低MLCK的活性,但其并不能降低MLCK的表达,而MLCK的表达升高可能不通过JNK的磷酸化实现,结论1.高脂血症与AS模型兔动脉MLCK的表达与活性发生明显改变,MLCK与MAPK信号转导通路有相关性。2. MLT通过降低MAPK相关蛋白的磷酸化调控AS模型兔动脉MLCK的活性和表达以及动脉内膜通透性,从而阻止AS的发生。3. MLT调控MLCK的分子机制可能是:通过ERK/MAPK与p38/MAPK通路调控MLCK的表达与活性,通过JNK/MAPK通路调控MLCK活性。