第一章积雪草酸对乳酸诱导的心肌细胞损伤的保护作用及机制研究目的:研究积雪草酸(Asiatic acid,AA)对乳酸(Lactate)诱导的心肌细胞损伤的保护作用,并探讨其可能的机制。方法:1.体外培养新生乳大鼠的原代心肌细胞,采用CCK-8法测定不同浓度AA(0、5、10、20、30μmol/L)和 Lactate(0、2.5、5、10、20、40mmol/L)对心肌细胞活力的影响。本实验中采用Lactate(20 mmol/L)刺激心肌细胞24 h来建立心肌细胞Lactate损伤模型,研究AA(20 μmol/L)预处理24 h对心肌细胞Lactate损伤的保护作用和机制。2.实验分为4组:①正常对照组(Control组):不加Lactate和AA处理;②AA组:细胞中只加AA(20μmol/L)预处理24h;③Lactate组:细胞只加Lactate(20 mmol/L)处理 24h;④Lactate+AA 组:AA(20μmol/L)预处理 24h,再加 Lactate(20 mmol/L)处理 24 h。3.经DCFH-DA染色,用流式细胞仪检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)浓度。4.经JC-1染色,用流式细胞仪和荧光显微镜观测线粒体膜电位。5.经Annexin V-FITC/PI染色,用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡。6.经TUNEL染色,荧光显微镜观察心肌细胞凋亡。7.提取心肌细胞胞质和线粒体蛋白,Western blot法检测心肌细胞胞质Cytochrome c、Cleaved-caspase 9、Cleaved-caspase 3 以及线粒体单羧酸转运蛋白 1(Monocarboxylate transporter 1,MCT1)等蛋白的表达。结果:1.Lactate(20 mmol/L)刺激24 h导致心肌细胞活力显著下降,细胞内ROS浓度显著升高,线粒体膜电位显著下降,心肌细胞凋亡率显著增加,MCT1、Cytochrome c、Cleaved-caspase 9 和 Cleaved-caspase 3 蛋白表达均显著增加。2.AA(20μmol/L)预处理24h显著抑制乳酸诱导的心肌细胞损伤,降低细胞内ROS的生成,抑制线粒体膜电位的下降,降低心肌细胞凋亡率。并显著增加线粒体MCT1蛋白的表达,降低 Cytochrome c、Cleaved-caspase 9 和 Cleaved-caspase 3 蛋白的表达。结论:积雪草酸可以保护心肌细胞,其机制包括抑制氧化应激和线粒体凋亡通路活化,以及上调线粒体MCT1蛋白的表达。第二章积雪草酸对小鼠主动脉弓缩窄术后心力衰竭的保护作用和机制研究目的:研究积雪草酸(AA)对小鼠心力衰竭的保护作用,并探讨其可能的保护机制。方法:1.采用 C57BL/6 小鼠,通过主动脉弓缩窄术(Transverse aortic coarctation,TAC)建立心力衰竭的动物模型,于术后第8周末使用心脏超声检测小鼠心室大小及心功能,处死小鼠后取出心脏,分离左心室,计算左心室重量/体重比(Left ventricular r weight/body weight,LVW/BW)。2.实验分为三组:①假手术组(Sham组);②单纯手术组(TAC组);③TAC+AA组:TAC术后第5-8周,AA(100 mg/kg)灌胃,每天一次。每组10只小鼠。3.比色法测定心肌组织内乳酸和丙二醛(MDA)浓度。4.经TUNEL染色,荧光显微镜观察心肌细胞凋亡。5.提取心肌细胞胞质和线粒体蛋白,Western blot法检测心肌组织胞质Cytochrome c、Cleaved-caspase 9 和 Cleaved-caspase 3 以及线粒体单羧酸转运蛋白 1(Monocarboxylate transporter 1,MCT1)等蛋白的表达。结果:1.TAC术后8周小鼠心脏明显增大,LVW/BW明显增加,心超显示出现明显的心肌肥厚,同时心室腔明显扩张,心功能明显下降,出现心力衰竭。而AA治疗后可以显著降低TAC小鼠的LVW/BW,减轻心肌肥厚,抑制心腔扩张,改善心功能。2.TAC术后8周小鼠心肌组织中乳酸浓度和线粒体MCT1表达均显著增加。AA治疗可以显著降低TAC小鼠心肌组织内乳酸浓度,并进一步增加线粒体MCT1蛋白的表达。3.TAC术后8周小鼠心肌组织内MDA含量显著升高,心肌细胞凋亡率显著增加,线粒体凋亡相关蛋白(Cytochrome c,Cleaved caspase-9 和 Cleaved caspase-3)的表达也显著增加。AA治疗可以显著降低TAC小鼠心肌组织内MDA含量和线粒体凋亡相关蛋白的表达,抑制心肌细胞凋亡。结论:积雪草酸可以抑制心力衰竭的发生发展,其机制包括抑制氧化应激和线粒体凋亡通路活化,以及上调线粒体MCT1蛋白的表达。