动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是许多心脑血管疾病的发病病理学基础,其机制复杂,是冠心病、心肌梗死、心绞痛等疾病死亡的主要原因。动脉粥样硬化的发生与炎症、氧化应激、脂蛋白聚集等密切相关,病理学特征性改变主要是内皮损伤、单核细胞黏附、脂质颗粒聚集、泡沫细胞形成以及血管平滑肌细胞增殖迁移,最终导致内膜增生和粥样斑块的形成。通心络(Tongxinluo,TXL)作为一种中药复合制剂,由十二种动植物草药成分组成,已经应用于临床二十多年,是由人参、酸枣仁、赤芍、檀香、降香、水蛭、蝉蜕、蜈蚣、全蝎、土鳖虫、乳香及冰片等十二味中药的复方提取物。多项研究已经证明该药可以明显改善内皮功能,降低血脂水平,减少动脉粥样硬化的形成并稳定易损斑块,因此,具有很大的临床应用价值。外泌体是一类细胞在特定条件下外分泌的小囊泡,包含有许多遗传物质,发挥细胞间信息传递的作用。外泌体包含的微小RNA是以RISC蛋白复合物结合的形式存在,处于可直接与信使RNA相互作用的功能性状态,发挥特定生物学功能。近些年来,外泌体作为心血管疾病的治疗靶点被越来越多地研究人员所重视,并且有很多研究已经证实外泌体对心脏的保护起着重要的作用。因此,本研究重点探讨平滑肌细胞源性外泌体在动脉粥样硬化疾病中的作用机制以及药物的干预研究。第一部分KLF5调控miR-155的分泌及其在动脉粥样硬化中的作用目的:探讨平滑肌源性KLF5对miR-155的调控作用及其对动脉粥样硬化的影响。方法:表达谱芯片和Real-time PCR检测平滑肌细胞中过表达pAd-KLF5或pAd后miRNA的表达。Real-time PCR和Western blot检测oxLDL诱导KLF5在平滑肌细胞中的表达。提取外分泌体,表达谱芯片和Real-time PCR检测KLF5诱导的平滑肌细胞源性miRNA外分泌情况。双荧光报告基因分析检测KLF5对miR-155启动子的激活作用。将标记PKH的外分泌体加入内皮细胞后固定,检测内皮细胞中外分泌体的荧光摄取情况。apoE-/-雄性小鼠尾静脉注射HASMC源性pAd或pAd-KLF5 exosome,饲喂高脂饲料,8周后取小鼠血管,免疫荧光观察CD31表达、油红O染色观察斑块形成以及原位杂交检测miR-155的表达情况。伊文氏兰染色检测apoE-/-小鼠与apoE-/-miR-155-/-小鼠的内皮渗透性。血管生成实验观察内皮细胞成血管和细胞间连接情况,Western blot检测内皮细胞紧密连接蛋白的指标,MTS实验和伤口愈合实验观察内皮细胞增殖和迁移能力。结果:1过表达KLF5调控多种miRNA在平滑肌细胞中的表达。表达谱芯片结果显示,平滑肌细胞中过表达pAd-KLF5与转染pAd相比能显著诱导43种miRNA的表达。Real-time PCR结果验证,过表达KLF5组中miR-155和miR-146a的表达量均高于pAd-GFP组,而miR-143,miR-145,miR-221,和miR-222表达量低于pAd-GFP转染组,与芯片结果一致。2 oxLDL调控miRNAs的表达。Western blot和Real-time PCR结果显示oxLDL可以显著诱导KLF5在平滑肌细胞中的表达。与过表达KLF5的结果相似,oxLDL可以显著诱导miR-155和miR-146a的表达,下调miR-143,miR-145,miR-221,和miR-222的表达。3过表达KLF5可以促进平滑肌细胞中miR-155的表达和分泌。电镜图片结果显示平滑肌细胞可以通过外泌体的形式来分泌miRNA。收集转染pAd或pAd-KLF5的平滑肌细胞培养基,超速离心,收集外分泌体,芯片筛查结果显示,miR-155在KLF5诱导的平滑肌细胞源性的外分泌体中含量显著增加。Real-time PCR结果显示,过表达KLF5或加入oxLDL刺激后外泌体中miR-155的表达比对照组增加,与基因芯片结果一致。当平滑肌细胞中同时过表达KLF5和加入oxLDL刺激时,Real-time结果显示miR-155的表达上升,当敲除KLF5后miR-155的表达下降。报告基因分析结果证明KLF5可以直接激活miR-155的启动子。4平滑肌源性miR-155通过外泌体进入内皮细胞。平滑肌细胞和内皮细胞Transwell共培养结果显示,上层平滑肌细胞过表达pAd-KLF5或加入oxLDL后,内皮细胞摄入荧光标记的miR-155的数量较对照组明显增加;而平滑肌细胞敲除KLF5后,内皮细胞摄入miR-155的数量显著减少。Triton X-100破坏外分泌体膜后,Real-time PCR检测结果显示miR-155在内皮细胞中的表达显著下降。将标记PKH的外分泌体加入内皮细胞后,发现平滑肌细胞过表达KLF5过表达可以显著促进内皮细胞对外分泌体的摄取。5 KLF5过表达的平滑肌源性外分泌体促进动脉粥样硬化的形成。apoE-/-雄性小鼠尾静脉注射HASMC源性pAd或pAd-KLF5 exosome,饲喂高脂饲料,8周后取小鼠血管,油红O染色结果显示,注射平滑肌源性pAd-KLF5 exosome组斑块明显多于pAd exosome组,提示KLF5过表达的平滑肌源性外分泌体促进动脉粥样硬化的形成6 miR-155通过抑制内皮紧密连接蛋白的表达促进动脉粥样硬化的形成。伊文氏兰染色结果显示apoE-/-小鼠内皮渗透性比apoE-/-miR-155-/-小鼠增强,提示miR-155的缺失有保护内皮作用。体外实验证实,KLF5过表达的平滑肌源性外分泌体后内皮细胞增殖、迁移和成血管能力下降。Western blot结果进一步证明,KLF5过表达的平滑肌源性外分泌体后内皮细胞紧密连接蛋白指标beta-catenin,ve-cadherin,claudin1,ZO-1表达均显著下降。内皮细胞的渗漏性结果显示,KLF5过表达的平滑肌源性外分泌体促进内皮细胞渗漏,给予anti-miR-155后,渗漏缓解。第二部分通心络抑制内皮细胞中miR-155的表达及分泌目的:观察通心络对动脉粥样硬化斑块的抑制作用及其机制。方法:荧光原位杂交检测miR-155的分布。细胞增殖和迁移实验检测过表达或敲低miR-155对巨噬增殖和迁移影响。实时定量PCR(qRT-PCR)检测TXL对miR-155的表达的影响。Western blot检测TXL对外分泌体包装蛋白LRP1,RAB27a和RAB22a表达的影响。结果:1 miR-155在动脉粥样硬化斑块组织中高表达。原位杂交显示人动脉粥样硬化血管组织中miR-155的表达明显高于正常血管组织。小鼠动脉粥样硬化斑块组织中miR-155的表达也明显高于正常血管组织。2 KLF5促进miR-155由内皮细胞进入巨噬细胞促进巨噬细胞的增殖和迁移。Transwell实验结果表明,KLF5或oxLDL促进miR-155由内皮细胞进入巨噬细胞。敲除KLF5后,巨噬细胞对miR-155的摄入明显减少。细胞增殖迁移实验也发现,过表达miR-155可以显著增加巨噬细胞的增殖和迁移活性,当敲低miR-155时,细胞增殖和迁移能力显著下降。3 TXL抑制KLF5介导的miR-155的表达及分泌。apoE-/-小鼠分别给予高脂饮食或高脂饮食灌胃TXL 12周后,油红染色结果显示,通心络显著抑制动脉粥样硬化斑块的形成。体外实验进一步证实,预孵育TXL可以显著抑制过表达KLF5和oxLDL诱导的miR-155表达。Western blot结果进一步发现,预孵育TXL后,外分泌体包装蛋白LRP1,RAB27a和RAB22a的表达下降。结论:1过表达KLF5或加入oxLDL可调控多种miRNA在平滑肌细胞中的表达。2过表达KLF5可以促进平滑肌细胞中miR-155的表达和分泌。3 miR-155在动脉粥样硬化斑块组织中高表达。4平滑肌源性miR-155通过外泌体进入内皮细胞,抑制内皮紧密连接蛋白的表达,损伤内皮,促进动脉粥样硬化的形成。5 KLF5促进miR-155由内皮细胞进入巨噬细胞促进巨噬细胞的增殖和迁移。6 TXL抑制KLF5介导的miR-155的表达及分泌。