草鱼微卫星标记开发及9个养殖群体遗传多样性分析

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草鱼(Ctenopharyngodon idella)在黑龙江、珠江和长江等水域中分布广泛,是我国最重要的淡水养殖鱼类。本研究通过磁珠富集法,分离筛选多态性微卫星标记400余个,为草鱼遗传连锁图谱加密工作打下基础;建立了5组适用于检测草鱼不同群体遗传多样性的微卫星多重PCR体系;对来自国内外共9个草鱼养殖群体进行了遗传多样性研究,以期为草鱼种质资源的监测、评估和利用提供理论依据。主要内容如下:1.草鱼多态性微卫星标记的筛选与分析通过改进的磁珠富集法,以生物素标记(CA)10和(GACA)6作为探针,构建以两碱基和四碱基为重复单元的草鱼微卫星文库,一共得到3000余条含有微卫星片段的序列。设计引物,并依次通过AGE和PAGE电泳检测,成功筛选出多态性微卫星引物465对,从中随机挑选25对,对60个黑龙江草鱼基因组DNA进行扩增和STR分型,分析其多态性水平。结果显示:此25个微卫星位点全部表现出多态性,每个位点等位基因数量在3-15之间,平均值为6.52;观测杂合度0.350-0.950;期望杂合度0.439-0.843;3个位点表现出偏离群体哈迪-温伯格平衡(P<0.05);18个位点显示出高水平的多态信息含量(PIC>0.5),可以作为草鱼遗传连锁图谱加密的备用标记,同时也能够作为草鱼遗传多样性、遗传结构等研究的理想微卫星标记。2.适用于检测草鱼不同群体遗传多样性的微卫星多重PCR体系建立通过从草鱼遗传连锁图谱和自主开发的微卫星磁珠富集文库中挑选出杂合度高、且位点丰富的多态性微卫星标记共53个,合成荧光引物,经4个不同野生草鱼基因组DNA二次筛选、组合,建立起5组多重PCR体系(共20个微卫星标记),通过来自沅江、成都、洪湖和安乡群体共80个草鱼基因组DNA进行多态性检测。结果显示:等位基因数(Na)介于8-28之间,有效等位基因数(Ne)介于3.09-19.66之间,观测杂合度(Ho)介于0.713-0.975之间,期望杂合度(He)介于0.681-0.955之间,多态信息含量(PIC)介于0.652-0.947之间,20个微卫星位点全部属于高度多态性位点(PIC>0.5)。此20个多态性微卫星位点的多态信息含量、杂合度和等位基因数均属于较高水平,能够提供丰富的遗传信息,适用于草鱼不同群体的遗传多样性和遗传结构检测分析。3.国内外9个草鱼养殖群体的遗传多样性分析利用自主开发的多重PCR体系,对来自长江流域(沅江、成都、洪湖和常德安乡)、天津、韶关以及越南北宁、印度戈勒克布尔和尼泊尔黑道达共9个草鱼养殖群体进行了遗传多样性和遗传结构分析。遗传多样性分析显示,所有位点均为高度多态性位点(PIC介于0.542-0.950),9个养殖群体显示出较高的遗传多样性水平(Ho介于0.552-0.972),国内6个以及越南群体的遗传多样性水平相对较高。瓶颈效应显示,9个群体杂合过剩严重,除成都群体外,其余群体都不同程度偏离突变-漂移平衡,说明由于人为因素,草鱼养殖群体数量近期发生骤降,遗传基因的正常世代传递和改变(遗传漂变)受到严重威胁。群体遗传分化指数(FST)和AMOVA分析结果表示,群体内以及群体间均显示出极显著遗传分化,整体分化水平较高(群体间53%达到了低度或中度遗传分化, FST>0.05)。遗传距离分析和UPGMA聚类树结果显示,国内6个群体间遗传距离较近;越南和国内群体遗传距离相对较近,印度和尼泊尔群体较为独立。遗传结构分析显示,9个群体被划为6个理论群,安乡和韶关群体较独立,其余3个长江流域和天津群体遗传信息相似,国内群体(除韶关外)与越南群体遗传信息渗透广泛,印度和尼泊尔群体遗传结构独立性极高。
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