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缺血性脑血管病是人类致死致残的首要疾病,它一直是国内外学者研究的中心课题。目前有关脑缺血再灌注研究的焦点已经从神经元转移到星形胶质细胞。作为中枢神经系统中数量最多的一类细胞一星形胶质细胞在中枢神经系统损伤后的反应在一定程度上决定着中枢神经的再生和功能的恢复。脑缺血后由于缺血半暗带区有大量的星形胶质细胞的聚集必将影响梗死体积的变化。目前,缺血半暗带区向梗死区转变所涉及的确切病理生理机制不清,但有大量的证据表明NO参与脑缺血的发生发展机制,N0可能是调节可挽救的缺血半暗带区转变成梗死区的最为重要的分子之一。 星形胶质细胞活化时可通过释放N0而损伤神经元,N0可能是缺血半暗带区神经元发生迟发性坏死最为重要的因素,了解星形胶质细胞表达NOS的动态变化,积极地干预治疗必将影响缺血半影区的转归,促进病人的功能恢复。 【目的】:本实验主要以培养的星形胶质细胞为研究对象,建立体外缺氧及复氧环境模拟体内缺血再灌注损伤模型,观察星形胶质细胞的形态和iN0s表达的变化及中药参麦注射液干预作用。 f方法l:利用新生24小时内的Wistar大鼠新鲜脑组织为原材料,经机械分离和化学消化,制成细胞悬液。按一定浓度接种在培养板内,经过8~9天后传代。当传至第四代,生长稳定、自然纯化后,可以进行鉴定,大约有95%以上为阳性细胞符合实验要求。 将符合实验要求的星形胶质细胞分为正常对照组、模型组、药物干预组,以5%CO2+95%N2混合气体造成缺氧,以乳酸脱氢酶(LDH)漏出率作为细胞受损指标,噻唑蓝(MTT)降解率评测细胞活力。在Hl2/R24小时对参麦注射液(5%、10%、15%、2O%)进行浓度筛选,选取一个合适的浓度进行药物干预。应用免疫细胞化学技术观察星形胶质细胞缺氧12小时后不同复氧时间点的GFAP、iNOS的表达情况及药物干预效果,同时进行形态半定量分析结果并应用倒置相差显微镜对细胞进行形态学观察。 【结果】: 1、模型组中星形胶质细胞在缺氧12小时细胞的形态、LDH和MTT变化不明显,随着再复氧时间的延长,细胞呈损伤性变化表现为细胞肿胀、变圆,胞浆颗粒变性,突起增粗缩短, <WP=37>细胞间连接断裂,呈纤维样改变,轮廓不清,甚至细胞脱落成悬浮状。细胞上清液中LDH漏出率增加,细胞存活率MTT下降二者呈时效反变关系。2、参麦注射液对星形胶质细胞的缺氧再复氧损伤有保护作用,在20%的浓度范围内呈剂量依赖性.根据实验结果选取20%作为干预浓度。3、模型组中H12/R14 GFAP的表达强阳性细胞数增多,药物干预组可减少GFAP表达的强阳性细胞数。两者相比有统计学意义(P<0.05) 4、正常组有少量的NOS的表达,模型组中缺氧12小时表达增多,与正常组比较有统计学意义( P(0.05)此后随着复氧时间的延长表达增多更加明显、在复氧48小时达到高峰,复氧72小时表达下降,20%的参麦注射液干预组可降低iNOS的表达。 【讨论及结论】:缺氧状态下,细胞由正常代谢转为无氧酵解为主,而星形胶质细胞对于缺氧有较好的耐受性,缺氧造成的损伤相对较小,缺氧12小时后突然恢复氧供应,星形胶质细胞氧化代谢在一定时间内代偿加强,产生大量的氧自由基攻击细胞膜,造成细胞的损伤,与此相适应细胞的LDH和MTT有相应的变化。在本实验中我们成功的建立了缺氧复氧损伤模型。缺氧复氧诱导星形胶质细胞的iNOS的表达,由于其在中枢神经系统内数量最多,因此,它产生的NO是相当大的,而超过生理剂量的NO就会对神经系统产生毒害作用。而在20%的参麦注射液干预组观察到细胞的形态正常发展、LDH漏出率下降、MTT降解率升高、GFAP的强阳性细胞数下降、iNOS的活性降低,说明参麦注射液可对抗缺氧再复氧损伤,其可能的机制是通过维持细胞的形态结构,稳定细胞膜、提高存活率。降低iNOS的表达实现的。