研究背景和研究目的目前癌症是除心脏病和脑血管病变以外的世界三大疾病之一,而在百余种不同病变的痛症中,至今尚未发现有特效的治疗方法。肺癌因其发现晚,高致死率在癌症治疗中成为一个全球性难题,而环境因素尤其是大气污染和不良生活习惯如抽烟也加剧了这一病症的发展。在所有类型的肺癌中,非小细胞肺癌占据比重高达85%,大概四分之三的患者发现时已处于中晚期,且5年存活率极低。目前除了手术切除外,化疗依旧是治疗肺癌必不可少的手段。但化疗药物副作用较大,病人化疗过程十分痛苦。因此亟需开发新的抑制肿瘤生长及发展的化合物。目前化合物抑制肿瘤生长的作用主要表现在抑制肿瘤细胞增殖和迁移及诱导肿瘤细胞发生凋亡等。抑制肿瘤增殖主要是通过阻滞细胞周期来实现的,利用化疗药物抑制细胞内DNA复制,将细胞周期阻滞在G0/G1期,从而阻止细胞分裂,达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。恶性肿瘤难以治愈的一个显著特点就是其高转移特性,肿瘤细胞实现这一生理过程主要依赖于细胞迁移,因此,抑制肿瘤细胞迁移也是治疗肿瘤的有效手段。自噬是哺乳动物中普遍存在的机制,这一保守过程在维持细胞稳态中发挥着极其重要的作用,在多种人类疾病,如神经退行性疾病、免疫失调、心血管疾病、糖尿病尤其是癌症中都发现不同程度的自噬失调。研究表明在多种癌症发生中都存在自噬相关基因不同程度的缺失。细胞凋亡即程序性细胞死亡,诱发癌细胞凋亡是很多抗癌药物作用的经典方式,而且自噬与凋亡关系密切,过度的自噬最终会诱导细胞凋亡。因此研究肿瘤细胞的自噬和凋亡的相互关系和作用,对于寻找肿瘤治疗的新靶点,建立肿瘤治疗的新策略都具有指导意义。化学遗传学利用具有细胞渗透性的化学小分子为研究工具,广泛应用在探究细胞信号通路和细胞内稳态维持中。化学小分子因其化学结构简单,易于进细胞并且具有作用可逆等优点已广泛应用于基因表达水平调控,信号通路转导以及免疫研究等领域。研究小分子化合物作用机制能为药物开发提供先导化合物,从而缩短抗癌药物开发过程,推动肿瘤治疗进程。综上所述,本研究旨在运用化学遗传学手段,筛选能够有效抑制肿瘤细胞生长的化学小分子,并进一步探究其抑制肿瘤细胞生长的具体机制,寻找小分子胞内作用靶点,以期发现新的治疗肿瘤的分子靶点,建立高效的肿瘤治疗机制。研究内容1.筛选能够抑制A549细胞生长的化学小分子;2.探究化学小分子在细胞内的分布;3.研究化学小分子在细胞水平及组织水平的作用效果;4.研究化学小分子抑制A549细胞生长的分子机制;研究方法1.A549及HUVECs细胞的培养;2.倒置荧光显微镜观察A549细胞形态变化;3.SRB法检测细胞存活率;4.AO染色检测细胞核断裂情况;5.LDH法检测细胞是否坏死;6.激光扫描共聚焦显微镜观察LC3点状聚集情况;7.免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3I/II及mTOR的下游底物4EBP1,p70S6K的磷酸化水平变化;8.RNA干扰研究化学小分子抑制mTOR活性的作用机制;9.免疫荧光法检测mTOR,LC3与化学小分子共定位情况;10.激光扫描共聚焦显微镜检测小分子化合物在细胞中的亚定位;11.免疫印迹法检测化合物对p21和p27的水平影响;12.流式细胞术分析细胞周期分布;13.鸡胚尿囊膜实验检测化学小分子体内肿瘤抑制效果。研究结果1.化学小分子5a-5i的处理引起A549形态变得不规则;2.化学小分子5a-5i能显著抑制A549细胞增殖,但对正常细胞HUVECs生长无影响;3.化学小分子5a-5i短时间处理不引起A549细胞凋亡;4.除化合物5f外,其他化学小分子不诱导A549细胞坏死;5.化学小分子5a-5i诱导细胞自噬;6.化合物5e诱导mTOR依赖的完整自噬流;7.化合物5e通过FKBP12抑制mTOR的活性;8.化学小分子5a-5i具有良好的荧光特性,5e与溶酶体共定位;9.化合物5e抑制体内肿瘤生长并且不影响正常血管生成;10.化合物5e诱导实体瘤内肿瘤细胞凋亡;11.化学小分子5a-5i能阻滞A549细胞周期;12.化合物5e抑制A549细胞迁移。结论1.化学小分子以浓度和时间依赖的方式抑制A549细胞增殖,其中化合物5e,5g,5h效果较好。2.化合物在短时间内诱导细胞自噬而非细胞凋亡,不引起细胞坏死;并且化合物5e诱导完整的自噬流,其诱导的自噬是mTOR依赖的。3.化合物5e通过FKBP12抑制mTOR的活性。4.化学小分子还能阻滞A549细胞周期,抑制A549细胞迁移。5.该批化学小分子均具有良好的荧光特性,其中5e荧光最强,且该化合物与溶酶体共定位。