肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)是各种肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同表现和主要病理基础,是多种慢性肾脏病发展到终末期肾衰的共同途径。各种病因导致的慢性、进展性肾脏疾病的最终归宿是肾间质纤维化,其特征性病变为肾小管萎缩、大量炎性细胞浸润、肌成纤维细胞活化,导致细胞外基质成分(extracellular matrix,ECM)过度堆积,最终取代正常肾脏结构,造成肾脏功能不全与丧失。大量临床实践和实验数据表明,肾间质纤维化轻重程度是决定肾脏疾病预后的重要因素。因此,对肾间质纤维化机制的深入研究将有助于揭示肾间质纤维化发生与发展的规律,从而找出相应的治疗对策。我们根据多年的临床实践及实验研究,结合慢性肾衰发病机理及祖国医学对“关格”、“癃闭”、“虚劳”病因病机的认识,提出了慢性肾衰益气活血降浊的治疗原则,制定出一整套治疗慢性肾衰的综合方案,以期达到扶正驱邪,标本兼治的目的。目的：采用单侧输尿管梗阻(UUO)的方法建立肾间质纤维化大鼠模型,通过整体动物实验,以福辛普利钠片为对照药,观察益气活血降浊复方对肾小管上皮细胞转分化(EMT)机制中的E-钙黏连素(E-cadherin),α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的影响,以及对UUO大鼠TGF-β1-smad-ILK信号转导通路的影响,探讨益气活血降浊复方延缓慢性肾衰竭进展及拮抗肾间质纤维化的作用机制。方法：1整体动物实验1.1雄性SD大鼠132只,体重(200±10)g,随机分为正常组,假手术组,模型对照组,益气活血降浊复方大、中、小剂量组,益气活血降浊复方由广安门医院制剂室按既定工艺提纯获得,每1ml提取液含生药4.8g,益气活血降浊复方大剂量组按照0.72ml/100g灌入,中剂量组按照0.36ml/100g灌入,小剂量组按照0.17ml/100g灌入,西药福辛普利钠治疗组10mg/kg/d灌入,模型组和正常组则灌入相应生理盐水。1.2术后第1、2、3周时,各组分别随机取6只大鼠置于代谢笼收集尿液,测定24小时尿蛋白含量。1.3术后第1、2、3周时,大鼠股动脉取血,分离血清,测定其中BUN及Scr,血清白蛋白的含量,并摘取右肾观察病理形态学变化。石蜡切片后做常规HE染色、Mallory染色。并记录大鼠体重,以及体重/肾重的变化。1.4采用免疫组织化学方法检测大鼠肾组织E-cadherin、α-SMA、TGF-β1、ILK.HGF.Smad7.Psmad2/3蛋白的表达,以及益气活血降浊复方治疗后对其变化的影响。1.5分子生物学检测：real-time PCR测定大鼠肾组织第1、2、3周时α-SMA mRNA.TGF-β1 mRNA.HGFmRNA的表达。2统计分析实验数据采用SPSS16.0统计软件进行组间比较的方差分析,结果表示为(x±s)。应用相关分析方法了解各指标之间的相互关系；最后初步分析益气活血降浊复方对大鼠肾间质纤维化的相关指标的影响,探讨其抑制肾间质纤维化的作用机制。结果：1益气活血降浊复方对UUO大鼠药效学疗效评价首先,益气活血降浊复方治疗组能改善UUO大鼠的一般状态,但对体重影响不明显；并能有效降低肾脏肥大指数,降低大鼠肾重体重比。其次,益气活血降浊复方能降低UUO大鼠24小时尿蛋白定量,但对大鼠血清肌酐,血清白蛋白无显著影响。实验证实：UUO大鼠虽然右侧肾脏梗阻,但左侧的肾脏足以代偿,益气活血降浊复方对降低UUO大鼠尿素氮有一定作用。最后,从肾间质损伤病理评分可见益气活血降浊复方能减轻UUO大鼠肾组织病理损害程度。2益气活血降浊复方防治肾纤维化的分子机制研究2.1益气活血降浊复方对E-cadherin,α-SMA蛋白表达的影响通过免疫组织化学显色图片分析得出：与正常组、假手术组相比,模型组大鼠在第1、2、3周E-cadherin蛋白在肾小管上皮细胞的胞浆中表达明显减少(P<0.01),益气活血降浊复方大、中、小剂量组较正常组,假手术组在各个时间点E-cadherin蛋白表达有所减少,但与模型组比较显著增加(P<0.01),西药福辛普利钠组较模型组表达也显著增加(P<0.01),具有统计学意义。本实验中益气活血降浊大剂量组在各个时间点增加E-cadherin蛋白效果最好且与西药组相当,中小剂量组虽然能增加E-cadherin蛋白,但效果逊于大剂量组和西药组。而模型组大鼠第1、2、3周α-SMA蛋白在肾小管上皮细胞的胞浆中较正常组、假手术组表达明显增加(P<0.01),中药大、中、小剂量组较正常组、假手术组在各个时间点α-SMA蛋白阳性表达有所增加,但与模型组比较显著减少(P<0.01),西药组较模型组阳性表达也显著减少(P<0.01),具有统计学意义。本实验中益气活血降浊大剂量组在各个时间点降低α-SMA蛋白效果最好且与西药组相当,中小剂量组虽然能降低α-SMA蛋白表达,但和大剂量组和西药组相比存在差异。2.2益气活血降浊复方对TGF-β1-smad-ILK信号转导通路的影响本实验从中医益气活血降浊的组方机制出发,探讨益气活血降浊复方对TGF-β1-smad-ILK信号转导通路的影响,实验通过对TGF-β1-smad-ILK各因子的研究证实：益气活血降浊复方对TGF-β1-smad-ILK信号转导通路有抑制作用益气活血降浊复方大、中、小剂量组较正常组,假手术组在各个时间点TGF-β1, p-smad2/3以及ILK蛋白阳性表达有所增加,但与模型组比较阳性表达显著降低(P<0.01),本实验中益气活血降浊大剂量组在各个时间点降低TGF-β1, p-smad2/3,ILK蛋白阳性表达效果最好且与西药组相当,中、小剂量组虽然能降低TGF-β1,p-smad2/3,ILK蛋白,但与大剂量组和西药组存在差异。而中药大、中、小剂量组较正常组,假手术组在各个时间点smad7蛋白阳性表达有所减少,但与模型组比较显著增加(P<0.01),具有统计学意义。本实验中益气活血降浊复方大剂量组在各个时间点增加Smad7蛋白表达的效果最好且与西药组相当,中、小剂量组虽然能增加Smad7蛋白表达,但与大剂量组和西药组存在差异。说明益气活血降浊复方通过抑制TGF-β1、p-smad2/3.ILK表达上调Smad7的表达,从而影响TGF-β1-smad-ILK信号传导通路,抑制了肾间质纤维化发展。总之,益气活血降浊复方可能是通过调节TGF-β/smad信号传导通路,并抑制其下游效应器ILK蛋白表达,使EMT合成增加而降解减少进而发挥了抑制肾间质纤维化的作用。2.3益气活血降浊复方对UUO大鼠肾组织TGF-β1mRNA,α-SMA mRNA,HGF蛋白及其mRNA的表达实验结果表明：正常组肾组织肾小管上皮细胞胞浆中呈弱阳性表达,随着梗阻时间的延长,模型组HGF蛋白表达逐渐减少,益气活血降浊复方大、中、小剂量组与西药福辛普利钠组较模型组HGF蛋白阳性表达显著增加(P＜0.01),具有统计学意义。本实验结果说明：益气活血降浊复方大、中、小剂量组和福辛普利钠组可促进内源性HGF生成,在一定程度上抑制肾间质纤维化。本实验也从基因水平证实：第1周正常组,假手术组HGF基因低表达,益气活血降浊复方大、中、小剂量组与模型组比较有显著差异,可明显升高HGF基因的表达,具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。第2周模型组肾组织α-SMA基因的表达最明显,第3周时益气活血降浊复方大、中、小剂量组与模型组相比有显著差异,可明显降低α-SMA基因的表达,具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。第3周模型组肾组织TGF-β1基因的表达比正常组,假手术组明显升高(P<0.05),益气活血降浊复方小、中剂量组与模型组相比,可明显降低TGF-β1基因的表达(P<0.05)。结论：11益气活血降浊复方对UUO大鼠肾脏有一定的保护作用。其一,益气活血降浊复方治疗组能增加UUO大鼠体重；其二,益气活血降浊复方能改善UUO大鼠肾功能,降低UUO大鼠尿素氮,但对UUO大鼠血清肌酐,血清白蛋白无显著影响；其三,益气活血降浊复方能降低UUO大鼠肾脏肥大指数,降低大鼠肾重体重比；其四,益气活血降浊复方能够减少UUO大鼠24h蛋白尿的排泄；最后,从肾间质损伤病理评分可见益气活血降浊复方可以减轻UUO大鼠肾脏病理损害。2益气活血降浊复方可能通过抑制α-SMA蛋白表达,上调E-cadherin蛋白表达,影响肾小管上皮细胞转分化,减少细胞外基质蛋白的合成,增加其降解,从而减缓肾间质纤维化的发展3益气活血降浊复方通过下调肾组织TGF-β1, p-smad2/3, ILK蛋白的表达,上调Smad7蛋白表达,从而影响TGF-β1-smad-ILK信号传导通路,推测其可能是其防治肾间质纤维化的机理之一4益气活血降浊复方大、中、小剂量组可以促进内源性HGF蛋白和基因的生成,在一定程度上抑制肾间质纤维化,另外益气活血降浊复方大、中、小剂量组在一定程度上使肾组织α-SMA基因、TGF-β1基因低表达,从蛋白质、基因水平为中医药治疗肾间质纤维化提供了作用靶点。