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禽流感(Avian Influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)引起的一种禽类感染和/或疾病综合征,被世界动物卫生组织(OIE)和我国定为A类传染病。自1878年首次在意大利暴发以来,已在世界各地广泛流行。近年来,AI出现了新特点,尤其是高致病性禽流感病毒(HPAIV)通过抗原漂移和抗原转变,已获得了感染人并造成死亡的能力,这赋予了HPAIV更重要的公共卫生学意义。目前,AIV致病机制还不甚清楚,可能是多基因共同作用的结果。其中,非结构蛋白(Non-structural protein,NS1)只存在于病毒感染的细胞内,是在细胞水平上的调节AIV致病性的关键因子。NS1蛋白主要是通过其RNA结合区和效应区与宿主内的许多蛋白相互作用来实现的,但这些研究大多数是采用人流感及其适应性细胞来研究的,而利用AIV及其天然宿主的研究还未见报道。因此,深入开展HPAIV的NS1蛋白与其天然宿主蛋白之间的相互作用研究,可进一步揭示NS1蛋白的功能及其调节HPAIV致病力的机制。因此,本研究利用HPAIV及SPF鸡为实验材料,运用组织病理学及蛋白质相互作用技术,研究了SPF鸡感染AIV的细胞凋亡、NS1蛋白的分布及NSl蛋白的相互作用蛋白,取得了如下成果:1 H9N2亚型AIV NSl基因的遗传进化分析利用RT-PCR方法,扩增了1998-2005年间分离的9株H9N2亚型AIV的NS1基因,序列分析表明,9株AIV NS1基因完整的阅读框均为654bp,编码217个氨基酸,其核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为95.4%-99.8%和93.6%-100%;9株病毒的NS1蛋白的C-端均缺失了13个aa,已成为中国大陆分离株(H9N2亚型)的一个分子标记。进化分析表明,所有分离株都属于基因A群,形成了一个独立分支,且均起源于中国最早的分离株(Ck/BJ/1/94株),说明H9N2亚型AIV的NS1基因随着流行时间出现了分化。另外,除Ck/HN/A3/98株外其余8株属于Ck/SH/F/98-like,这说明了Ck/SH/F/98-like株的H9N2亚型AIV在中国大陆鸡群中广泛存在。2 SPF鸡感染高致病性禽流感病毒(H5N1亚型)细胞凋亡的研究用末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT-mediated X-dUTP nick end labling,TUNEL)研究了SPF鸡人工感染HPAIV(H5N1亚型)的细胞凋亡,结果表明,HPAIV(H5N1亚型)能诱导各脏器不同程度的细胞凋亡,以胸腺、法氏囊、胰脏、肾脏的细胞凋亡最严重,凋亡细胞主要为血管内皮细胞、腺上皮细胞、软骨细胞及部分淋巴细胞。本研究表明,HPAIV可诱导本动物发生快速的细胞凋亡。3 HPAIV(H5N1亚型)NS1蛋白在感染鸡组织中分布研究利用NS1蛋白单克隆抗体,建立了检测NS1蛋白的免疫组化法(SABC法),并研究了HPAIV感染30-31h后NS1蛋白在鸡各脏器中的分布,结果表明,NS1蛋白主要分布于心脏、胰脏、肾脏及小脑颗粒层;阳性细胞主要为各组织器官的小或微血管内皮细胞、心肌细胞、肾小管上皮细胞、腺上皮细胞、部分淋巴细胞及坏死灶周围的细胞,说明了心肌、胰腺、肾脏、小脑及血管内皮细胞可能是HPAIV的主要靶器官。结合细胞凋亡的研究结果,可推测,心血管系统在HPAIV的复制和扩散中起重要作用。同时也证明了NS1蛋白与细胞凋亡有相关性。4利用酵母双杂交系统筛选NS1蛋白相互作用的宿主蛋白本研究利用SMART技术首次构建了HPAIV感染鸡脾脏cDNA文库,然后利用酵母双杂交系统从该cDNA文库中初步筛选到了4个能与NS1蛋白相互作用的蛋白,序列测定和Blast分析表明,4个基因分别为鸡源ISG12-2、IRF2、PPM1F及AIV的M蛋白,其中ISG12-2和IRF2基因含完整阅读框。推测,NS1蛋白可能是通过调节干扰素的产生、自身磷酸化及调节病毒复制等方式来发挥其调节AIV致病力的功能。这些蛋白的获得,进一步解释了NS1蛋白在调节HPAIV致病性方面的作用,同时也为HPAIV感染人的机制提供了有意义的参考。5利用细菌双杂交系统和GST融合蛋白沉降技术验证NS1蛋白与ISG12-2和IRF2蛋白的相互作用本研究利用细菌双杂交系统和GST融合蛋白沉降技术进一步验证NS1蛋白分别与ISG12-2及IRF2蛋白的相互作用,结果表明,在体内和体外,NS1蛋白与ISG12-2及IRF2蛋白间存在相互作用。NS1蛋白与ISG12-2和IRF2的相互作用,可能抑制某些IFN表达相关通路,拮抗IFN的表达,降低机体的抗病毒状态,利于AIV的复制和扩散。