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第1章引言T细胞耗竭首先定义于慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染,是一种T细胞功能缺陷的状态,在慢性感染和肿瘤环境中普遍存在。当慢性感染和肿瘤发生时,T细胞在抗原持续性刺激过程中,高表达程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）、T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白域蛋白-3（TIM-3）、B和T淋巴细胞衰减子（BTLA）、细胞毒T细胞抗原4（CTLA-4）、淋巴细胞活化基因（LAG-3）、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白（TIGIT）等免疫抑制性受体（inhibitory receptors,IRs）。此外,T细胞耗竭也是诱导免疫耐受的机制之一。现阶段T细胞耗竭在器官移植耐受领域研究尚少,虽然已有研究报道T细胞耗竭在诱导自身免疫耐受和器官移植耐受中发挥作用,然而耗竭性T细胞对移植物排斥和诱导器官移植的免疫耐受还有待进一步的研究。本课题将系统探讨miRNA在癌症发生和器官移植后如何调控T细胞耗竭,为增强抗肿瘤免疫治疗效果和延长移植物在器官移植后移植物存活提供新的策略。第2章miR-149-3p调控IRs及细胞因子分泌逆转小鼠乳腺癌CD8+T细胞耗竭目的:探讨miRNA是否能够通过调节乳腺癌小鼠脾脏CD8+T细胞免疫检查点蛋白提高抗肿瘤免疫应答。方法:使用miRNA基因芯片分析4T1乳腺癌荷瘤小鼠脾脏CD8+T细胞PD-1高表达群体中表达下调的miRNA。应用多数据库联合分析筛选出与多个IRs基因3’UTR存在结合位点的候选miRNAs。体外转染候选miRNAs,运用RT-q PCR和流式细胞术验证miRNA对耗竭性T细胞的调节功能。结果:miR-149-3p与免疫抑制受体PD-1、TIM-3、BTLA和Foxp1基因3’UTR存在理论结合位点。在转染miR-149 mimic后,细胞凋亡、耗竭性T细胞表型以及PD-1、TIM-3、BTLA、Foxp1转录水平的基因表达均下调。与此同时,效应性细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ的分泌水平以及T细胞的增殖能力,在转染miR-149 mimic后显著升高。体外使用miR-149 mimic转染T细胞,检测CD8+T细胞对4T1乳腺癌细胞的杀伤作用,显示miR-149 mimic能够增强CD8+T细胞的细胞毒性。结论:综上所示,miR-149-3p能够通过逆转T细胞耗竭提高CD8+T细胞的抗肿瘤免疫应答,提高抗乳腺癌肿瘤免疫治疗的效果。第3章miR-5119调控DC IRs配体增强抗肿瘤免疫治疗效果目的:验证miR-5119转染肿瘤DC疫苗是否能够通过逆转乳腺癌T细胞耗竭提高CD8+T细胞抗肿瘤免疫应答。方法:运用RT-qPCR和流式细胞术评价4T1乳腺癌荷瘤小鼠脾脏DC中IRs配体和miR-5119的表达水平。应用多数据联合分析,明确miR-5119存在理论结合位点的免疫抑制分子。应用miRNA瞬时转染技术联合RT-q PCR和流式细胞术,检测miR-5119 mimic或miR-5119 inhibitor转染DC后,PD-L1和IDO2的表达水平。进而运用miR-5119转染DC疫苗治疗4T1乳腺癌荷瘤小鼠,监测肿瘤的生长速度和CD8+T细胞耗竭表型。结果:miRNA-5119在乳腺癌荷瘤小鼠脾脏DC中显著下调。miRNA靶点预测分析和RT-q PCR结果显示,miRNA-5119能够靶向免疫抑制分子PD-L1、IDO2基因的3’UTR。结果还显示,与正常小鼠相比,在4T1乳腺癌荷瘤小鼠脾脏细胞中IRs的配体PD-L1、Galectin-9、HVEM等表达水平升高,可进一步诱导T细胞出现耗竭表型。利用miRNA-5119基因修饰DC疫苗治疗乳腺癌荷瘤小鼠,在体外和体内实验中均能够有效逆转耗竭性CD8+T细胞的耗竭表型,增强乳腺癌荷瘤小鼠效应细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ的分泌能力,抑制T细胞凋亡,促进T细胞增值能力以及CD8+T细胞对4T1肿瘤细胞的杀伤能力,从而抑制4T1荷瘤小鼠的肿瘤生长,提示miR-5119基因修饰DC疫苗可显著提高抗乳腺癌免疫治疗的效果。此外,miRNA-5119转染DC疫苗还可靶向Foxp3分子,抑制体内Treg细胞的比例,进而提升宿主抗肿瘤免疫能力。结论:本研究证明miR-5119转染的DC疫苗作为一个新型的肿瘤疫苗方法,可有效增强DC疫苗抗肿瘤免疫能力,在抗乳腺癌免疫治疗中发挥重要作用。第4章miR-5119 inhibitor调控DC IRs配体诱导心脏移植耐受目的:验证miR-5119 inhibitor转染DC是否能够促进受体T细胞耗竭,延长同种异体心脏移植小鼠供体移植物的存活时间。方法:应用雷帕霉素诱导心脏移植的免疫耐受小鼠,并比较移植耐受小鼠和排斥小鼠脾脏DC中IRs配体的表达水平。应用miRNA基因芯片联合miRNA靶点预测分析,筛选出能够靶向负向调控PD-L1基因的候选miRNAs。运用miR-5119 mimic或miR-5119inhibitor转染DC治疗心脏移植小鼠,评价心脏移植物在受体小鼠体内的存活时间结果:miR-5119在雷帕霉素诱导的心脏移植耐受小鼠中的表达水平显著下调。miRNA基因芯片分析和q-PCR结果一致,显示miR-5119在免疫耐受小鼠脾脏DC中表达显著增高。miRNA靶点预测分析结果同样显示miR-5119能够靶向负性调控分子PD-L1和IDO2。结果显示IRs配体PD-L1,Galectin-9和HVEM在免疫耐受小鼠脾脏DC中的表达水平上调。提示miR-5119能够负向调控IRs配体的表达水平。用miR-5119 inhibitor转染DC治疗心脏移植小鼠能够有效延长移植心脏在受体小鼠体内的存活时间,并上调PD-L1和IDO2基因表达。此外,miR-5119 inhibitor转染的DC还能够诱导心脏移植小鼠体内T细胞耗竭表型和Treg细胞比例上调,诱导心脏移植小鼠免疫耐受。结论:本研究证实miRNA-5119 inhibitor转染DC作为一个有效的手段能够,能够通过促进受体小鼠T细胞耗竭,诱导免疫耐受,延长心脏移植物的存活时间。