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协同刺激信号在T淋巴细胞参与的免疫应答过程不同阶段发挥重要的调控作用。程序性死亡受体1(Programmed death-1,PD-1)是B7家族成员之一,而程序性死亡配体1(Programmed death ligand-1,PD-L1)为协同刺激分子PD-1的配体之一。PD-1主要表达于活化的T、B、单核细胞表面。PD-1/PD-L1介导的负性抑制信号可通过抑制T、B淋巴细胞功能参与多种疾病的发生、发展。研究发现,许多协同刺激分子除以细胞膜型外,还有可溶性形式存在,如CD28、CTLA-4(细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4)、CD80、CD86、B7-H3和B7-H4等,这些可溶性因子的生物学意义及与临床疾病的相关性尚待研究。通过研究PD-1/s PD-L1途径对T淋巴细胞功能的影响,并阐明其作用机理,有望为人类疾病的免疫治疗提供新策略。本研究通过观察不同浓度s PD-L1对人T淋巴细胞功能的影响及PD-1胞浆区信号接头分子酪氨酸蛋白酶(SHP)-1、SHP-2及磷酸化SHP-1(p-SHP-1)、p-SHP-2的改变,并分析其生物学意义,揭示PD-1/s PD-L1协同刺激信号对T淋巴细胞的抑制机理,进一步探究s PD-L1如何起负性调控作用。一、可溶性PD-L1通过PD-1/s PD-L1途径抑制T淋巴细胞功能【目的】分析s PD-L1对T淋巴细胞增殖、周期、凋亡的影响。【方法】应用流式细胞术测定健康人外周血T淋巴细胞膜表面活化前后的PD-1分子的表达,应用CCK-8法体外研究不同浓度s PD-L1对T淋巴细胞增殖的影响,确定抑制T淋巴细胞增殖的最低浓度,并流式细胞术测定此浓度s PD-L1对T淋巴细胞周期及凋亡的影响。【结果】健康人外周血T淋巴细胞低表达PD-1,活化的T淋巴细胞表面则高表达PD-1,可溶性PD-L1蛋白(s PD-L1Ig)工作浓度为250 ng/ml时能通过PD-1/s PD-L1途径抑制T淋巴细胞的增殖(P=0.017),低于此浓度的s PD-L1Ig均未能引起T淋巴细胞增殖的抑制(P>0.05),特异性阻断PD-1/s PD-L1抑制信号可部分恢复T淋巴细胞的增殖活性(P=0.035);s PD-L1Ig促使细胞周期G1期T淋巴细胞百分比明显增高(P=0.000),特异性阻断该抑制信号可降低G1期T淋巴细胞百分比(P=0.014);s PD-L1使T淋巴细胞凋亡率明显增高(P=0.001),加入阻断剂后可部分逆转T淋巴细胞的凋亡率(P=0.002)。【结论】可溶性PD-L1可通过PD-1/s PD-L1途径抑制活化T淋巴细胞的增殖,促使细胞周期停滞在G1期,促进其凋亡,s PD-L1表达的增高,可能与细胞免疫调节作用相关。二、PD-1/s PD-L1信号通路接头分子SHP-1、SHP-2在对T淋巴细胞功能抑制作用中的意义【目的】检测不同年龄段健康人血清中s PD-L1表达水平及s PD-L1作用下PD-1接头分子蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP)-1和SHP-2的募集量,探讨s PD-L1激发PD-L1/s PD-1信号通路抑制信号的机制。【方法】选取2013年6月至2014年5月于苏州大学附属第二医院体检中心健康志愿者108例,采用酶联免疫吸附方法检测20-30岁,31-50岁,51-70岁年龄组人群血清中s PD-L1表达水平。免疫磁珠法分离健康人外周血T淋巴细胞,将细胞分为5组:A组:静止T淋巴细胞组、B组:活化T淋巴细胞组、C组:活化T淋巴细胞+s PD-L1Ig组、D组:活化T淋巴细胞+s PD-L1Ig+m Ig G组、E组:活化T淋巴细胞+s PD-L1Ig+2H11组。免疫沉淀法沉积PD-1接头分子SHP-1和SHP-2,Western印迹法检测各组细胞SHP-1,p-SHP-1,SHP-2,p-SHP-2分子表达量。【结果】健康人外周血中存在s PD-L1分子表达,20-30岁年龄组的表达水平最低,其浓度约为(0.766±0.154)ng/ml,31-50岁组表达水平为(0.866±0.201)ng/ml,51-70岁年龄组则具有更高表达水平(1.047±0.453)ng/ml。20-30岁组与31-50岁组、51-70岁组、31-50岁组与51-70岁组s PD-L1分子表达水平均有统计学意义(P=0.000;P=0.000;P=0.001)。根据第一部分细胞功能实验结果,s PD-L1仍采用250 ng/ml工作浓度,并按前述细胞处理方法进行分组,各组细胞SHP-1、SHP-2的表达量(灰度值)差异均无统计学意义(均P>0.05);C组p-SHP-1、p-SHP-2表达量均显著高于B组(P=0.000;P=0.000);E组p-SHP-1表达量显著低于D组(P=0.028)。【结论】健康人外周血中s PD-L1中表达水平与年龄有关;加入s PD-L1后p-SHP-1、p-SHP-2表达量均显著高于未加入s PD-L1组,可能与PD-1/s PD-L1抑制途径有关。特异性阻断PD-1/s PD-L1抑制途径抑制信号可部分恢复p-SHP-1功能,p-SHP-1在PD-1/s PD-L1抑制途径中起重要作用。综上所述,本课题研究获得了以下研究结果:(1)s PD-L1Ig能抑制T淋巴细胞的增殖,使T淋巴细胞周期停滞在G1期,促进T淋巴细胞凋亡。通过PD-L1阻断型单抗可部分恢复T淋巴细胞的功能。提示s PD-L1是通过与T淋巴细胞表面的PD-1结合而产生负性免疫调控作用。(2)健康人外周血中s PD-L1表达水平与年龄有关;s PD-L1促进PD-1接头分子p-SHP-1、p-SHP-2的表达,特异性阻断PD-L1可部分恢复p-SHP-1功能。提示p-SHP-1在PD-1/s PD-L1抑制途径中可能起重要作用,进而抑制T淋巴细胞的功能。