两栖动物来源的天然同源二聚体多肽通过抑制炎症促进皮肤组织再生

来源 :昆明医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wangxingyu2009
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[目的]皮肤是人体与外界环境之间重要的物理屏障,承担着诸多且重要的生理功能,但容易受到多种因素(物理性、机械性、化学性及病原微生物性等因素)的影响造成皮肤破损。皮肤破损后内环境稳态的重建重要先决条件就是伤口的快速愈合,而创伤愈合的过程有序且复杂,容易受到不同因素的影响发展为慢性创伤或肥厚性瘢痕愈合。现有促创伤修复药物及治疗手段都存在一定局限性,因此,寻找新型促进皮肤创伤修复类药物至关重要。两栖动物皮肤源性多肽在大量研究中表现出良好的促进创伤修复的活性,在此研究中我们从云南臭蛙(Odorrana andersonii)皮肤分泌物中鉴定出一条新型多肽OA-GP11 dimer,探究此小肽的促皮肤创伤修复能力与其他功能,为其成为新型促皮肤创伤潜在候选药物奠定基础。[方法]在此项研究中,野外采集成年云南臭蛙(O.andersonii),电刺激法收集臭蛙皮肤分泌液,并从其皮肤分泌物中鉴定得到一条新型多肽OA-GP11 dimer。通过cDNA克隆,并结合质谱分析结果发现其为多肽OA-GP11的同源二聚体。通过NCBI数据库检索比对后发现此多肽为一种新的多肽,并将其命名为OA-GP11 dimer。我们检测该多肽二聚体的抑菌活性、溶血活性及急性毒性。通过一系列的体外细胞实验(1.MTS实验检测体外OA-GP11 dimer对小鼠角质细胞(PAM212)和小鼠巨噬细胞(Raw264.6)的增殖活性;2.体外细胞划痕实验检测OA-GP11 dimer对小鼠角质细胞(PAM212)的促创伤修复活性;3.体外Transwell小室实验检测OA-GP11 dimer对小鼠角质细胞(PAM212)和小鼠巨噬细胞(Raw264.6)的促迁移活性。)及体内整体动物水平的创伤愈合模型构建实验探究小肽的促创伤愈合活性及可能的作用机制;并通过病理组织学分析、细胞因子释放活性检测、转录组分析和细胞信号通路检测,进一步探究该活性小肽促进创伤愈合的组织学水平、分子水平作用机制。[结果]1.从云南臭蛙皮肤分泌物中鉴定出新型多肽OA-GP11 dimer,由22个氨基酸残基组成,其氨基酸序列为“GPLSGINAE(?)EANIGSLPG”,相对分子质量为2180.54 Da。2.OA-GP11 dimer不具有对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌)、真菌(白色念球菌)、枯草芽孢杆菌的抗菌活性,以及对ABTS+无抗氧化活性;同时不表现出对小鼠红细胞的溶血活性和昆明小鼠的无急毒活性。3.OA-GP11 dimer对小鼠角质细胞(PAM212)和小鼠巨噬细胞(Raw264.6)无明显促进细胞增殖活性,但也无抑制活性。在迁移(细胞划痕)及侵袭(Transwell)实验中表现出较好的促进小鼠角质细胞迁移的能力。4.OA-GP11 dimer能够显著加速小鼠全皮层创伤和烫伤创伤的愈合,促进伤口的快速愈合和再上皮化的形成。5.通过ELISA检测发现OA-GP11 dimer可以显著抑制在LPS刺激诱导的Raw264.7细胞中炎性因子(TNF-α和IL-6)的释放。6.通过转录组结果,发现OA-GP11 dimer处理组较空白对照组共有1010个差异表达基因,其中有437个上调基因,573个下调基因;且通过KEGG通路富集图,根据相关通路差异基因富集因子大小,发现NF-κB信号通路的显著性差异表达。且Western blot实验结果显示OA-GP11 dimer可有效下调LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κB以及I-κB的磷酸化。[结论]云南臭蛙皮肤源性多肽OA-GP11 dimer能有效促进小鼠急性创伤(全皮层创伤)和慢性创伤(烫伤)的修复;且通过LPS刺激诱导小鼠巨噬细胞炎症反应处理后,小肽OA-GP11 dimer不仅可以下调I-κB以及NF-κB的磷酸化的表达,且还能抑制炎症因子的释放,这在创伤模型中多肽处理组能表现出良好的创伤修复活性是尤为重要的。此项研究丰富了两栖类蛙皮肤来源的皮肤修复肽的作用和机制,是首个具有促组织再生活性的肽类二聚体,且在高炎症水平动物模型(烫伤)中显示出较好的修复组织再生活性。为OA-GP11 dimer能够作为开发成促皮肤创伤修复潜在药物先导分子奠定了一定基础。
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