背景与目的异氟醚是临床常用的吸入麻醉药,具有麻醉效果好,血气分配系数较低,易于调控麻醉深度,对循环影响小等优点。体外研究发现,异氟醚具有浓度和时间依赖性细胞毒性。在体研究也表明异氟醚可诱导发育期大脑广泛的神经凋亡,并造成持续的认知功能障碍。虽然异氟醚诱发神经凋亡作用机制的研究屡有报道,但其关键毒副作用靶点仍有许多不明之处,影响了临床防治的开展。研究发现,活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)积聚是异氟醚神经毒性作用的重要节点,然其诱导ROS产生的具体机制不明。异氟醚可以直接作用于线粒体 ATP 敏感性钾通道(mitochondrial adenosine triphosphate-sensitive potassium channel,mitoKATP)并促其开放,又知其它mitoKATP开放剂可致线粒体ROS产生增多,但mitoKATP的开放是否参与异氟醚神经毒性尚不清楚。此外,研究表明新生成2周左右的未成熟神经细胞对异氟醚尤其敏感,成为相关研究特别关注的热点。STAT3参与胚胎期中枢神经再生和分化,小鼠出生后3天到21天脑组织中STAT3表达逐渐增高。STAT3表达水平的调控对发育期大脑神经细胞选择性自发凋亡,有效神经功能网络的形成有重要作用。STAT3通路激活是该阶段细胞生存依赖于神经营养因子的根本原因,而这个阶段,正是异氟醚诱导神经细胞凋亡并造成成年后学习记忆功能损伤最敏感的窗口期。但异氟醚神经毒性作用是否通过直接干扰上述STAT3神经保护和营养机制,目前并不清楚。本研究拟在建立异氟醚神经毒性作用动物和细胞模型的基础上,深入探讨mitoKATP以及STAT3在异氟醚神经毒性中的作用及其分子机制,为探索相应的临床防治措施提供科学依据。方法 1、使用新生7天的C57/BL6小鼠和U251人胶质瘤细胞,建立异氟醚神经毒性作用的动物和细胞模型。通过Western blot检测活化的caspase-3以及释放到胞浆的细胞色素C水平确定造模是否成功。2、评估异氟醚对线粒体功能的影响:用JC-1染色检测线粒体膜电位,用carboxy-H2DCFDA探针检测细胞内ROS 水平,检测异氟醚作用6小时内胞内ATP水平、NAD+/NADH比值变化。探讨mitoKATp以及ROS是否参与异氟醚对呼吸链功能的影响。3、探讨mitoKATP通道特异性阻断剂5-HD能否缓解异氟醚对线粒体功能的影响以及异氟醚诱导的发育期大脑神经细胞凋亡和成年后认知功能障碍。通过Annexin V/PI染色用流式细胞仪评估细胞凋亡水平,通过Western blot检测细胞和大脑皮质中活化的caspase-3等凋亡相关蛋白水平,用免疫组化的方法从形态学上检测大脑皮质和海马区域凋亡情况,对新生期接受异氟醚麻醉的小鼠四周后进行intellicage智能鼠笼检测评估小鼠学习记忆能力。4、分别从动物和细胞水平评估异氟醚麻醉后STAT3表达水平变化。通过Western blot检测STAT3、pY705-STAT3及其调控的下游蛋白水平,采用免疫组化和免疫荧光的方法从形态学上观察脑组织中STAT3、pY705-STAT3表达情况。5、探讨异氟醚影响STAT3表达水平的机制。采用RT-qPCR观察异氟醚对STAT3转录水平的影响。通过蛋白酶抑制剂MG132或钙调磷酸酶抑制剂FK506预处理观察异氟醚对总蛋白泛素化、STAT3蛋白以及凋亡相关蛋白水平的影响。6、采用质粒或siRNA使U251细胞中STAT3过表达或敲除,通过检测活化的caspase-3和ROS水平评估STAT3是否参与异氟醚神经毒性作用。结果 1、新生7天小鼠在1.7%异氟醚麻醉6小时后大脑皮质中活化的caspase-3水平增高,U251细胞在2%异氟醚处理6小时后释放到胞浆的细胞色素C增多,提示异氟醚神经毒性的动物和细胞模型成功建立。2、异氟醚诱导细胞线粒体膜电位降低、ROS积聚,ROS清除剂NAC预处理可缓解线粒体膜电位降低,mitoKATP通道特异性阻断剂5-HD预处理可阻断线粒体膜电位降低,5-HD或NAC预处理均可以阻断异氟醚诱导ROS积聚。异氟醚处理6小时内,ATP水平、NAD+/NADH比值呈先升高后降低特征,细胞在处理后2小时达高峰,动物在麻醉后1小时达高峰,4小时与基础水平相比无明显差异,6小时后显著降低。细胞内ROS水平在异氟醚处理2小时内无明显改变,4小时后显著升高。5-HD预处理可使ATP、NAD+/NADH、ROS水平不发生显著变化,NAC预处理ATP、NAD+/NADH升高后依然保持在较高水平,ROS水平与对照组相比无显著差异。3、细胞和动物水平研究结果显示5-HD预处理可减轻异氟醚诱导的细胞凋亡水平。新生期接受异氟醚麻醉的小鼠成年后在行为学检测中对设定的正确角落表现出一定的学习能力,但学习效率较正常小鼠低,位置学习第四天正确率显著低于未接受异氟醚麻醉的小鼠。进入反向学习阶段突然改变正确角落后,异氟醚麻醉的小鼠找到新设定正确角落的能力显著低于正常鼠。5-HD预处理可以缓解异氟醚诱导的此认知障碍。4、Western blot结果显示新生7天小鼠接受异氟醚麻醉6小时后皮质内总STAT3、pY705-STAT3、线粒体中STAT3以及STAT3正调控的下游基因Bcl-xl、survivin等蛋白水平均下降。免疫组化和免疫荧光染色结果显示大脑皮质和海马中STAT3蛋白水平下降明显,细胞实验中STAT3水平在胞核中下降更显著。5-HD预处理不能阻断异氟醚诱导的STAT3蛋白水平降低。5、异氟醚促进STAT3mRNA转录,增加STAT3蛋白降解,同时异氟醚也加速其他已泛素化蛋白的降解,而并不明显增加蛋白泛素化水平。异氟醚并未诱导致凋亡因子如Bim 等蛋白降解,其水平反而升高,这种差异性蛋白降解,加重了细胞凋亡的风险。MG 132阻断了异氟醚诱导的STAT3蛋白降解,但同时阻断其他蛋白如促凋亡蛋白Bim降解,加重异氟醚诱导的细胞凋亡。FK506可特异性阻断异氟醚诱导的STAT3降解,且并不影响其他蛋白,可发挥保护神经细胞作用。6、STAT3质粒成功转染并使细胞内总STAT3、pY705-STAT3以及线粒体中STAT3在异氟醚处理6小时后维持较高水平,阻断异氟醚诱导的抗凋亡蛋白如Mcl-1、survivin水平降低,并阻止细胞色素C从线粒体释放到胞浆中诱导凋亡。反之,STAT3 siRNA或抑制剂加重异氟醚造成的氧化损伤和凋亡水平。结论 1、异氟醚通过开放mitoKATP通道降低线粒体膜电位,促进呼吸链功能代偿性增高,ATP、NAD+/NADH水平升高,提高产能;该过程同时促使ROS产生增加,ROS过度积聚后破坏产能,激活线粒体内源性凋亡通路,造成细胞损伤。这种双向作用可能是异氟醚短时程发挥缺血再灌注损伤保护作用及长时程具有神经毒性的分子机制。2、阻断mitoKATP通道,或清除ROS积聚,可产生有效的神经保护作用。3、智能鼠笼检测方法能敏感地检出异氟醚造成的学习记忆功能损伤。这种认知功能障碍在学习任务较轻的情况下,主要表现为动物的学习放慢,掌握程度降低;在学习难度加大时,表现出对复杂情况处理的灵活性降低,不能迅速做出正确判断。4、异氟醚通过泛素化通路降解STAT3蛋白,STAT3降低是异氟醚神经毒性作用的机制之一。FK506通过特异性阻断STAT3降解,缓解异氟醚诱导的细胞凋亡。5、STAT3的保护机制主要是通过上调线粒体相关抗凋亡蛋白的表达,以及直接保护线粒体功能如抑制氧化应激和mPTP孔开放等。