牙周炎等多种原因造成的牙周支持组织丧失是成人牙齿脱落的首要原因，牙周炎的治疗和牙周缺损的修复是全世界关注的难题。虽然目前临床常见牙周治疗方法如洁治术、刮治术、翻瓣术等，能够控制牙周炎症的进展和阻止牙周支持组织的进一步丧失，却不能使缺失的组织获得良好的再生；引导组织再生术和植骨术的兴起，给牙周炎的治疗带来新的希望，但适应范围狭窄、疗效不稳定且可预见性差。近年来，组织工程研究取得突飞猛进的发展，使利用组织工程的原理、技术和方法实现牙周组织再生成为可能。自2004年美国学者从人牙周膜组织中成功分离出牙周韧带干细胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）以来，利用干细胞移植（stem celltransplantation）技术修复牙周组织缺损成为牙周组织再生研究的主要策略。在大动物对照试验研究中，利用骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）和PDLSCs修复牙周组织缺损都取得了很好的效果。2010年，世界上首篇将自体牙周膜来源的细胞用于牙周炎的临床治疗，文章发表在Oral Diseases上，将牙周细胞治疗的研究和临床应用推进到一个从所未有的高度。为了加快牙周细胞治疗的临床转化，选择适用范围广、操作简便、安全有效、经济实惠的细胞输送（cell delivery）方法成为我们必需解决的关键问题。研究表明，利用细胞膜片（cell sheet）技术可以保留细胞体外培养时形成的细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）和细胞与细胞之间的连接，从而避免外源性生物材料的应用，提高细胞移植的植活率。同时良好的生物相容性、可操作性、可量化控制、调节膜片的大小和厚度，使得细胞膜片技术成为细胞移植（cell transplantation）首选方法之一。1993年，日本学者Okano等建立了温度敏感性培养皿制备细胞膜片的方法，随后国内外学者就如何简便获得高效的细胞膜片方面进行了大胆的尝试。本实验室2010年报道了通过维生素C诱导培养获得细胞膜片的方法，使细胞膜片的制备变得更加简单。进一步深入探索安全有效且简便易行的膜片改良技术可以加速细胞治疗牙周病的临床转化进程。证据表明，中草药中具有多种生物活性分子，这些活性成分有望成为生长因子的替代品，用于细胞生物学性能的体内外调节研究中。天然化合物蛇床子素（Osthole）是从蛇床、欧前胡等传统中草药中提取的香豆素类化合物，价格便宜、制备简单；体内外试验中发现其具有促进细胞的增殖和骨向分化能力，可以有效的预防和治疗骨质疏松。因此，在细胞膜片制备过程中，加入蛇床子素有望会促进细胞膜片的形成，提高膜片的成骨效能。本课题旨在探索Osthole对PDLSCs和颌骨来源的BMMSCs（Jaw BMMSCs, JBMMSCs）两种细胞的膜片形成及其增殖与骨向分化能力的影响，为中药小分子化合物用于细胞膜片技术的改良和加速牙周细胞治疗的临床转化提供依据。目的：通过体外Osthole对人PDLSCs和JBMMSCs的生物学性能的影响，筛选合适的给药浓度；探索筛选浓度下，Osthole对两种细胞膜片形成及其成骨效能的影响，为中药小分子化合物用于细胞膜片技术的改良和加速牙周细胞治疗的临床转化提供依据。方法：1. PDLSCs和JBMMSCs的分离、培养和鉴定：采用改良组织块法、差异贴壁法分别培养原代牙周膜细胞和颌骨骨髓基质细胞；通过有限稀释法分离、纯化PDLSCs和JBMMSCs。流式细胞术检测相关干细胞表面标记物；噻唑蓝(methylthiazolyl tetrazolium, MTT)比色法、成纤维细胞集落形成单位（Colony formingunit-firbroblast, CFU-F）检测细胞自我更新能力；成骨、成脂诱导检测细胞的多向分化功能。2. Osthole最佳细胞作用浓度的筛选：设立Osthole不同浓度组（0Mol/L，10-4Mol/L，10-5Mol/L，10-6Mol/L和10-7Mol/L），通过MTT法检测细胞增殖、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色和ALP定量试剂盒检测细胞的ALP活性的方法，结合两种细胞的作用数据，确定Osthole最佳细胞作用的浓度。3. Osthole对两种细胞膜片形成和成骨性能的影响：按照筛选的Osthole浓度，进一步探索干预时间对两种细胞膜片形成和性能的影响。两种细胞均设：无Osthole干预组（Control组）、Osthole早期干预（前3天）组（Osthole1组）、Osthole全程干预组（Osthole2组）、Osthole后期干预（后3天）组（Osthole3组），细胞培养10天后获取细胞膜片，通过苏木精-伊红（hemotoxylin and eosin, HE）染色、扫描电镜（scanning electron microscope, SEM）、蛋白免疫印迹法（Weston-Blot）、实时定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction, RT-PCR）检测细胞膜片形成能力；同时，设置平行对照组，对细胞膜片进行成骨诱导，通过ALP染色、茜素红染色、RT-PCR检测其成骨能力，总结最佳的干预方法。4.体内异位移植，检测两种细胞膜片成骨能力：根据上述实验结果，获取最佳Osthole干预方法下制备的细胞膜片，对两种细胞膜片的体内异位成骨能力进行评价，无Osthole干预获得的细胞膜片作为对照。细胞膜片复合羟基磷灰石-磷酸三钙（Hydroxyapatite-tricalcium phosphate, HA-TCP）植入裸鼠皮下，四周后取材，HE染色观察成骨效果。5.统计学分析：所有数据使用SPSS17.0软件统计分析处理，计量资料以均数±标准差（X±SD）形式表示，多个样本均数比较用方差分析，两两比较采用t检验，检验水准p值取双侧0.05.结果：1.所有标本均成功获得PDLSCs和JBMMSCs，显微镜下观察细胞均呈梭形，具有自我增殖能力和细胞克隆能力（PDLSCs16%±0.8%；JBMMSCs8.75%±0.6%），流式细胞检测显示STRO-1、CD105、CD29、CD90、CD146等间充质来源干细胞标记表达阳性，CD31、CD45造血干细胞标记表达阴性。成骨染色可见到钙化结节沉积，成脂染色可见脂滴的形成。2.经不同浓度Osthole干预培养后，MTT检测结果显示：浓度为10-5Mol/L的Osthole具有最显著的促进两种细胞增殖的效果（P<0.05）； ALP染色和ALP定量分析结果也显示10-5Mol/L为促进细胞骨向分化的最佳给药浓度。3. Osthole在不同时间点加入细胞培养液中，培养10天后HE染色显示：不同干预方法获得的PDLSC膜片，细胞层数多为1-2层，而JBMMSC膜片中，细胞层数多为2-3层；Weston-Blot和RT-PCR检测结果显示：在PDLSCs各组膜片中，Fibronectin蛋白合成和基因表达与对照组（无Osthole干预组）相比，明显上调，具有统计学差异（P<0.05）。JBMMSCs形成的膜片中，Osthol1组（早期干预）与其它组相比，I型胶原（Collagen-I,Col-1）、β1整合素（Integrin-β1）、纤连蛋白（Fibronectin）的蛋白分泌及相关基因表达水平明显增高（P<0.05）。4. Osthole干预诱导形成的细胞膜片经成骨诱导后，RT-PCR检测结果显示，对于JBMMSCs而言，Osthole1中的成骨相关基因[ALP、Runt相关转录因子2(RUNX-2)、骨钙素（osteocalcin,OCN）]表达明显提高（P<0.05）；而其余两组与对照组相比无明显差异（P>0.05）；而对于PDLSCs而言，Osthole2组（全程干预）中细胞的骨向分化趋势更为明显（P<0.05）。5.体内移植4周后，PDLSCs/osthole组、JBMMSCs组、JBMMSCs/osthole组形成的细胞膜片在HA-TCP表面及材料间隙之间均形成了大量的类骨质样新生骨，新生骨表面可见成骨样细胞及骨陷窝。而PDLSCs组虽然有新生骨的形成，但在材料表面主要以纤维包裹为主。定量分析显示Osthole干预组与未干预组相比，新骨形成量具有非常明显的统计学差异（P<0.001）。两种细胞间比较，无Osthole干预下，JBMMSCs具有更强的成骨能力（P<0.05），而经过蛇床子素干预培养后，两种细胞膜片新骨形成无统计学差异（P>0.05）。结论1. Osthole给药浓度对人PDLSCs和JBMMSCs的生物学性能产生不同程度的影响，10-5Mol/L浓度更有利于两种细胞的增殖和成骨分化。2. Osthole干预时间对两种细胞影响不同：在JBMMSC膜片形成早期、PDLSCs膜片形成全过程中使用浓度为10-5Mol/L的Osthole进行干预，可以获得具有良好成骨分化能力的细胞膜片。3.无论是PDLSCs，还是JBMMSCs，Osthole干预诱导形成的细胞膜片与未干预的细胞膜片相比，在体内均具有更强的异位成骨能力。