核酸适体-银簇复合体系构建及在细胞成像中的应用

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在生物医学诊断与检测、细胞成像领域,传统的抗原-抗体反应灵敏度和特异性均较好,酶联免疫反应在各种生物分子的探测中发挥着举足轻重的作用,市场上的许多试剂盒就是基于此原理开发的。但蛋白质作为探针分子,易受 pH、温度等环境因素影响而变性、且合成价格昂贵,适配体由 DNA或 RNA构成(主要是DNA),比蛋白质体积更小,可以拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度,同时合成更容易,稳定性更好。在不远的将来,适配体有望取代酶联免疫反应,成为各种化学分子探测的有力武器。荧光标记是识别分子进行信号表达和显示最重要的方式之一,常见的有标记有机荧光分子、无机量子点等。基于特殊核酸链结构合成的银簇具有较高荧光量子产率,是一种重要的无机量子点。本文设计合成了含有MUC1蛋白的核酸适体和合成银簇核酸结构元件的核酸链,原位合成得到具有靶向作用和荧光特性的核酸适体-银簇复合体系,并用于细胞成像研究,主要内容如下:  1.核酸适体-银簇的合成及其表征  本章设计合成了复合 DNA单链,含有核酸适体序列和富含胞嘧啶的核酸序列,并以复合 DNA链为模板,原位合成核酸适体-银簇(Apt-AgNCs)材料。通过对 DNA链与 AgNO3比例、环境温度、合成时间等条件考察,得到最佳合成条件为:DNA链与 AgNO3浓度比例为5μM:30μM(1:6);4℃、黑暗。合成得到的 Apt-AgNCs大小为8 nm左右,最大发射峰为535 nm,产生绿色荧光,且能够在4℃黑暗环境中能够长久保存(30天内荧光强度变化不明显)。  2. Apt-AgNCs对MUC1蛋白的检测  MUC1蛋白在肿瘤细胞表面过量表达,可以作为肿瘤细胞的靶向分子。本章通过考察 Apt-AgNCs与标准品 MUC1蛋白的结合实验,进一步验证原位合成银簇是否会影响核酸适体端对 MUC1蛋白的结合。凝胶电泳表明, Apt-AgNCs与MUC1蛋白能够识别结合,说明原位合成银簇不会影响核酸适体端对 MUC1蛋白的结合;但荧光实验发现,随着结合浓度升高,MUC1蛋白对 Apt-AgNCs荧光具有猝灭作用,这可能是结合后,对序列的稳定性产生影响,猝灭了银簇荧光,以此建立了 Apt-AgNCs对 MUC1蛋白的体外检测标准曲线。  3.Apt-AgNCs用于 MCF-7细胞成像研究  本章将合成的 Apt-AgNCs应用于细胞表面 MUC1蛋白过表达的 MCF-7细胞成像研究。实验从 Apt-AgNCs的浓度、成像时间、特异性识别等方面考察成像条件和成像效果。结果表明:在 Apt-AgNCs的浓度为2.5μM,处理2 h的时成像效果最佳。而与无核酸适体银簇比较,以及在无或者少量表达 MUC1蛋白的细胞株7704细胞和 MCF-10A细胞中成像比较,发现只有 Apt-AgNCs可以特异识别MCF-7细胞,并发射绿色荧光,其他处理均无荧光。说明 Apt-AgNCs可以用于MUC1蛋白过表达细胞的特异识别和成像,为其应用于细胞成像提供了实验基础,也为其他细胞特异识别和成像提高思路和理论依据。
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