丝素蛋白/壳聚糖三维多孔支架的构建及用于成骨细胞MG-63的培养

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【目的】  探讨丝素蛋白/壳聚糖(SF/CS)三维多孔支架的构建及成骨细胞MG-63在不同比例支架上的行为学,筛选出最适合用于骨组织工程的支架比例,为骨组织工程的治疗提供新的天然生物材料。  【方法】  第一部分:  1.通过脱胶、溶解、透析等流程从蚕茧提取丝素蛋白溶液(SF),并计算其浓度。  2.配制浓度 3%的壳聚糖溶液(CS),制备不同比例丝素蛋白/壳聚糖三维多孔支架(SF/CS)。  3.通过扫描电镜(SEM)研究不同比例三维支架的表面形态。  4.通过X-射线衍射(XRD)和红外光谱仪(FTIR)研究支架内部的构象。  5.研究SF/CS三维多孔支架在PBS中的膨胀率、双蒸水中的降解率。  6.利用75%酒精溶液研究 SF/CS 三维支架的孔隙率,利用茜素红在支架中的渗透能力研究支架的营养物质运输能力。  第二部分:  1.用浸泡过SF/CS三维支架的培养基培养MG-63细胞,通过MTT、Hoechst 法研究 MG-63 细胞在支架浸提液中的增殖能力,以评价支架是否具有细胞毒性。  2.将MG-63细胞种到辐照灭菌好的SF/CS三维多孔支架中,分别通过计算细胞在支架中的黏附率,通过MTT研究细胞在支架上的增殖情况来研究细胞和支架的相容性。  3.将MG-63细胞种到不同比例SF/CS支架中,石蜡包埋切片。通过HE染色研究MG-63细胞与SF/CS支架共培养时的形态。  4.通过SEM研究细胞在40SF、50SF支架中的形态。  5.通过研究MG-63细胞在40SF、50SF支架中的碱性磷酸酶活性(ALP)以初步评估成骨细胞MG-63在SF/CS三维支架中的成骨性能。  【结果】  第一部分:  1.通过本实验室流程,用时4天制备出浓度为3%左右的丝素蛋白溶液。  2.配制浓度为3%的CS溶液,用时6天制备出以下比例三维支架:100%SF、100%CS、50%SF-50%CS(50SF)、20%SF-80%CS(20SF)、30%SF-70%CS(30SF)、40%SF-60%CS(40SF)。  3.SEM图谱显示50SF与40SF支架表面形态相对其他比例规则,其中50SF支架表面最光滑。  4.XRD和FTIR结果显示添加CS后SF结晶度、构象发生了改变。  5.膨胀率结果显示膨胀率与 CS 含量呈正比。  6.降解率实验显示含交联剂的SF/CS三维多孔支架性质稳定,降解液呈中性。  7.不同比例支架中50SF、40SF支架孔隙率高于其他各组,且50SF支架孔隙率最高。  8.不同比例支架中50SF、40SF支架蛋白吸收性高于其他各组,且50SF组蛋白吸收性最好。  第二部分:  1.MG-63细胞在50SF、40SF支架浸提液中增殖能力最强,其余两组明显降低。说明支架无细胞毒性。  2.MG-63细胞在50SF、40SF支架中粘附率与其在正常培养皿中粘附率无统计差异。MTT检测结果显示MG-63细胞在50SF、40SF支架中增殖能力优于其他两组,且50SF支架组细胞增殖能力最好。  3.HE染色结果显示MG-63细胞在50SF、40SF中生长状态良好,且在50SF支架中存活数量多于40SF组。  4.SEM结果同样显示MG-63细胞在50SF支架中细胞量明显多于40SF。  5. MG-63 细胞在 50SF 支架中分泌 ALP 活性高于 40SF 组。说明50%SF-50%CS比例支架更适合成骨细胞MG-63的培养。  【结论】  丝素蛋白/壳聚糖三维多孔支架制备简便,不同比例支架表面形态、理化性质差异较大,SF与CS组分越相近,性能最优。第一部分证明50SF、40SF表面形态、孔隙结构、蛋白运输性能最好。第二部分相关细胞实验证明50SF支架最适宜成骨细胞的黏附、增殖长期培养,并对成骨性能做了初步检测。本研究初步探讨了适宜组织工程的生物材料,为生物材料在骨组织方面的应用提供了一个新思路。
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