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前言 Bcl-2相关抗凋亡蛋白3(BAG3)是BAG家族共伴侣蛋白的一员，分子结构包括WW结构域，富含脯氨酸的PxxP结构域和BAG结构域，通过它们能够使BAG3与伴侣蛋白或其他蛋白相互作用而参与多个信号转导的调控作用。BAG3具有抗凋亡，调控肿瘤细胞粘附和转移，诱导自噬等一系列生物学功能。 GRP78是位于内质网上重要的分子伴侣，属热休克蛋白70家族的一员。GRP78是包含654个氨基酸的高度保守分子，在N端有内质网信号肽和ATPase结构域，在C端有肽结合结构域和KDEL模体。GRP78作为一种分子伴侣参与蛋白质的折叠和转运、调节内质网钙稳态、抗内质网相关性细胞凋亡，以及启动未折叠蛋白反应等细胞生命过程。GRP78对肿瘤细胞有保护功能，因此抑制其基因表达或抑制其功能可作为化疗的目标或组成部分。例如，依托泊甙(etoposide)等药物也可通过一系列反应裂解GRP78，导致协同抗肿瘤作用。本课题组通过免疫共沉淀结合质谱分析鉴定出GRP78是尚未报道的BAG3结合蛋白，并通过免疫沉淀和GSTpulldown实验证明了BAG3与GRP78的肽结合结构域相互作用。 DNA损伤是复制过程中发生的DNA永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。依托泊甙和阿霉素都是比较典型的DNA损伤剂，能对肿瘤细胞产生细胞毒性，可用作化疗药物。研究表明GRP78通过其ATPase结构域与procaspase-7直接相互作用，从而抑制DNA损伤剂对procaspase-7的活化而抑制DNA损伤剂的抗肿瘤作用。一些能与GRP78的ATPase结构域相互作用的分子可以与procaspase-7竞争性结合GRP78而利于procaspase-7的激活，从而增加DNA损伤剂的抗肿瘤效果。本实验旨在解析BAG3与GRP78相互作用对GRP78与procaspase-7结合以及DNA损伤剂致肿瘤细胞细胞毒性的影响。 方法 1、培养HEK293、MCF7、FRO、U87细胞;BAG3稳定过表达的HEK293、MCF7、FRO、U87细胞;利用脂质体介导转染技术瞬时转染技术瞬时转染BAG3、GRP78procaspase-7或对照表达载体。 2、应用免疫荧光实验检验BAG3与GRP78或procaspase-7与GRP78在细胞内的共定位。 3、应用WesternBlot法检测BAG3、GRP78、procaspase-7和caspase-7的蛋白表达情况。 4、用caspase-3/7活性检测试剂盒检测caspase-3/7的活性。 5、应用MTT比色分析法检测细胞生存能力。 6、应用AnnexinⅤ-PE/7-AAD染色、流式细胞技术检测细胞凋亡情况。 结果 1、BAG3与procaspase-7竞争性地与GRP78结合。 2、BAG3促进依托泊甙和阿霉对procaspase-7的激活。 3、BAG3能使增强依托泊甙和阿霉素对肿瘤细胞的毒性作用。 结论 1、BAG3与procaspase-7竞争性地与GRP78相互作用。 2、BAG3增强肿瘤细胞对依托泊甙和阿霉素的反应性。