论文部分内容阅读
[背景]2型糖尿病(T2DM)是胰岛β细胞分泌胰岛素不足或靶细胞对胰岛素不敏感所致的以高血糖为临床主要表现的一种复杂疾病。长期高血糖状态会引发血管、神经的损伤,并出现一系列炎症反应,因此T2DM也被认为是一种慢性低度的炎症状态,它受到机体免疫系统的调控。胰腺中浸润的免疫细胞可以通过自分泌或旁分泌的方式干扰外周组织的胰岛素信号传导或诱导β细胞损伤,但由于T2DM发病机制的复杂性,免疫细胞在其中所起的具体作用及作用机制并不完全清楚。[目的]本课题采用db/db小鼠模型,探讨T2DM发生发展中胰腺组织内髓源抑制性细胞(MDSCs)、CD8+T和胰岛β细胞损伤之间的关系,阐明其调控作用及内在机制,并部分揭示壮药绶草中天麻苷修复胰岛β细胞损伤的过程及机制。[方法]以SPF级雄性db/db小鼠和同型对照鼠为研究对象,检测4-16周内小鼠体重、空腹血糖、糖耐量、胰岛素耐量变化;通过ELISA法检测外周血中炎症因子的表达;利用胰岛素抗体染色技术检测胰岛β细胞数量及功能。运用流式细胞术分析小鼠外周血、肝脏、脾和胰腺中MDSCs、CD8+T细胞、胰岛β细胞的比例,并分选胰腺MDSCs、CD8+T细胞和胰岛βp细胞进行实验。通过体外CD8+T细胞增殖抑制实验和细胞共培养实验,体内过继转移实验,观察胰腺MDSCs、CD8+T和胰岛β细胞之间的相互作用及方式。在体外,利用MTT实验检测绶草70%提取物中各成分对胰腺MDSCs细胞活力的影响;通过细胞增殖实验、Western blot和细胞爬片实验,检测绶草中天麻苷对胰腺MDSCs增殖的影响及内在信号通路中节点蛋白的表达变化。[结果]1.T2DM炎症与胰岛β细胞损伤的研究:(1)与WT小鼠相比,db/db小鼠体重、空腹血糖升高;糖耐量、胰岛素耐量受损;胰腺中MDSCs所占比例明显降低(P<0.01);CD8+T细胞的比例升高(P<0.001)。(2)16周时,与WT小鼠相比,db/db小鼠外周血中炎症因子IL-6、IL-β、TNF-α和TGF-β含量明显高于对照组(P<0.05);同时,胰岛β细胞数量和胰岛素的分泌减少。2.T2DM胰腺中MDSCs对CD8+T细胞介导的胰岛β细胞损伤作用的研究:(1)胰腺组织中,db/db小鼠MDSCs趋化因子CCL2的基因表达和胰腺MDSCs的比例显著低于WT小鼠(P<0.001)。胰腺MDSCs与胰岛β细胞不接触,而部分CD8+T细胞浸润在胰岛中,与胰岛β细胞相邻。(2)体外实验结果显示,胰腺MDSCs抑制CD8+T的增殖。胰岛β细胞与CD8+T细胞共培养时,β细胞数量减少;加入胰腺MDSCs后,胰岛β细胞存活率升高(P<0.001)。3.绶草中天麻苷可以显著增强胰腺MDSCs细胞活力,并在0.25 ng/ml的浓度时最为显著(P<0.01);天麻苷对胰岛β细胞活力无直接影响。4.天麻苷(0.25 ng/ml)处理胰腺MDSCs后,其增殖峰显著增多。Western-blot检测结果显示,天麻苷(0.25 ng/ml)处理胰腺MDSCs中p38、P-p38、ERK、p65蛋白表达明显增多(P<0.01)。胰腺MDSCs细胞表面TNFR2受体敲除后,天麻苷对细胞p38和p65蛋白表达没有影响。[结论]1.胰腺MDSCs通过抑制CD8+T细胞的增殖改善CD8+T细胞介导的胰岛β细胞的损伤。2.壮药绶草中天麻苷通过激活TNFR2/MAPK信号通路,促进MDSCs细胞增殖进而修复胰岛β细胞损伤。