“灵薏方”为临床抗肺癌验方,由灵芝和薏苡仁组成,具有补气养阴,利水渗湿,消瘤软坚的作用。本论文在传统中医药理论与现代医药理论的指导下,选择“灵薏方”为研究对象,采用超临界CO2萃取(SFE-CO2)和液液萃取等提取纯化技术,获得了“灵薏方”中的抗肺癌活性组分。为解决有效组分灵芝三萜和薏苡仁油溶解性较差,而灵芝多糖和薏苡仁多糖口服吸收差等问题,本课题采用微乳给药系统负载上述组分以提高有效组分的溶解性促进其吸收。本课题利用薏苡仁油作为微乳中的油相,负载灵芝三萜,并将灵芝多糖和薏苡仁多糖加入水相,结合使用表面活性剂及助表面活性剂,采用水滴定法制备了高载药量的“灵薏方”多组分微乳,并表征其理化性质,对制剂的质量进行了评价。通过“细胞和动物”模型研究了“灵薏方”多组分微乳的抗肺癌活性,并结合肿瘤组织病理切片和TUNEL凋亡检测对其抗肺癌作用机制进行了初步探讨。本研究结果表明,“灵薏方”多组分微乳平均粒径小、分布均匀、载药量高、质量稳定,提高了有效组分的体内外抗肺癌活性。本文首先对灵芝和薏苡仁的化学成分、抗肿瘤进展及中药微乳研究进展进行了文献综述。实验部分研究内容主要包括以下几个方面:1.“灵薏方”各单味药品种、产地的选择及有效组分的提取纯化与成分表征实验首先采用HPLC法、紫外可见分光光度法测定有效成分的含量,并结合课题组前期体外抗肿瘤活性实验,优选出了实验所用药材的品种与产地,其中灵芝为江苏东台的赤芝,薏苡仁为河北的薏苡仁。运用现代提取纯化技术对有效组分进行提取富集,最终得到有效组分群为灵芝三萜、薏苡仁甘油三酯、灵芝多糖、薏苡仁多糖。(1)采用超临界CO2萃取技术分别对灵芝三萜类组分和薏苡仁甘油三酯类组分进行萃取,结果灵芝三萜得率为3.75%,纯度为61.50%;薏苡仁甘油三酯得率为6.62%,纯度为 74.35%。(2)采用水提醇沉、Sevag去蛋白的方法提取纯化灵芝和薏苡仁中的多糖类组分,结果灵芝多糖得率为6.56%,纯度为46.40%;薏苡仁多糖得率为8.40%,纯度为64,42%。2.“灵薏方”多组分微乳的制备、表征及质量评价本研究以薏苡仁中的抗肿瘤有效组分薏苡仁油为微乳油相,负载灵芝中的抗肿瘤有效组分灵芝三萜,通过单因素与伪三元相图结合的方法,以此为基础将多糖类组分溶解于水相,制备了“灵薏方”多组分系列微乳,并对微乳的平均粒径、Zeta电位等理化参数进行表征,通过载药量及稳定性考察对微乳进行质量控制。(1)优选得到的系列微乳处方为:①灵芝三萜:薏苡仁油:1944CS;RH40:PEG400:水=75 mg:132.5 mg:267.5 mg:400 mg:200 mg:2600 mg(微乳1、ME-1)。②灵芝三萜:薏苡仁油:RH40:PEG400:水=75 mg:400mg:400 mg:200mg:2600 mg(微乳 2、ME-2)。③灵芝三萜:薏苡仁油:RH40:PEG400:水:灵芝多糖:薏苡仁多糖=75 mg:400 mg:400 mg:200 mg:2600 mg:131.2 mg:507.5 mg(微乳 3、ME-3)。(2)对所制备的3种微乳进行表征,ME-1、ME-2、ME-3的平均粒径分别为41.13 nm、47.59nm、69.92 nm;PDI分别为 0.199、0.156、0.060;Zeta 电位分别为-13.74 mV、-16.98 mV、-11.30 mV。用透射电镜观察3种微乳的外观形态,外观均较圆整,分布均匀。(3)载药量和稳定性是评价微乳质量的重要指标,本研究测定了所制备的3种微乳的载药量,分别为4.18%、9.87%、17.71%。对3种微乳在稀释、pH、高速离心、长时间放置等条件下的稳定性进行考察,结果表明3种微乳在上述情况下均较稳定。3.“灵薏方”多组分微乳的体内外抗肺癌活性研究(1)“灵薏方”多组分微乳体外对人肺癌A549细胞生长的抑制作用采用MTT法,对“灵薏方”有效组分的不同比例配伍及所制备的“灵薏方”多组分微乳的抗肺癌活性进行研究。实验结果表明,混悬液1、混悬液2、ME-1及ME-2对人肺癌A549细胞的IC50分别为1.42、1.55、0.77、0.62mg生药·mL-1。结果表明所制备的微乳显著增强了灵芝三萜和薏苡仁油的体外抗肺癌活性,且ME-2对人肺癌A549细胞的IC50要显著小于ME-1,表明ME-2具有更强的体外抗肺癌活性,因此对ME-2及以ME-2为基础水相中加入多糖的ME-3进行了体内抗肺癌活性研究。(2)体内抗肿瘤药效评价采用Lewis荷瘤小鼠动物肺癌实体瘤模型,以抑瘤率和免疫调节指数为评价指标,对“灵薏方”有效组分的混悬液及ME-2、ME-3的药效进行研究。实验结果表明,在给药剂量为30g生药·kg-1·d-1时,ME-2、ME-3及其对应的混悬液的抑瘤率分别为67.41%、57.25%、44.63%、45.89%,与生理盐水组比较,有明显的抗肺癌作用(p<0.05);微乳组的抗肺癌作用显著优于混悬液组(p<0.05);与环磷酰胺及生理盐水组相比,“灵薏方”相关给药组的肝指数、胸腺指数、脾指数和血浆中TNF-α、IL-6的含量均有明显提高(P<0.05),说明“灵薏方”中有效组分及微乳制剂不但能抑制肿瘤细胞,而且能协同增强机体免疫活性,从而共同发挥抗肿瘤的作用,充分体现了中药复方“多组分多途径多靶点”抗肿瘤的整体优势。4.“灵薏方”多组分微乳的抗肺癌机制初探本研究从肿瘤组织切片和TUNEL凋亡检测对“灵薏方”多组分微乳的抗肺癌作用机制进行了初步探讨。结果表明“灵薏方”多组分微乳具有促进肿瘤组织坏死和肿瘤细胞凋亡的作用机制,且具有剂量依赖性。此外本文还以微乳为溶剂系统提取灵芝中的活性组分等方面进行了研究:(1)以微乳为溶剂,同时提取灵芝中脂溶性和水溶性组分,为微乳用于灵芝多组分的提取提供了实验依据。(2)针对灵芝三萜与多糖的溶解特性,以优选的空白微乳作为溶剂超声处理灵芝药材粉末,探索了一种集提取与制备一体化的灵芝多组分微乳一步制备法。