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食管癌是一种高度恶性的人类消化系统肿瘤,其发病率和死亡率均居世界肿瘤疾病前列。目前我国是世界上食管癌死亡率最高的国家之一,发病率居全国各类恶性肿瘤第5位,死亡率居第4位,均远超世界平均水平。食管癌分为鳞癌和腺癌,其中鳞癌占90%,研究发现近年食管鳞癌发病率呈下降趋势,而腺癌发病率却呈现增高趋势。近半个世纪以来,国内外关于食管癌的发病机制的研究已在DNA,RNA及蛋白领域取得了一些成果,但其确切的发病机制目前仍在积极的研究探索之中。随着分子靶向治疗及免疫治疗的研究,许多药物正逐渐进入食管癌治疗领域。但食管癌的靶向治疗,免疫治疗相对滞后,尚无确实有效的药物医用于临床,尤其能够临床应用有效的药物相对缺乏,因此食管癌迫切需要新颖的治疗模式。L-A(Licochalcone-A,甘草查尔酮A)是一种存在于各种食用植物中的黄酮类化合物,具有广泛的药理特性,如抗癌、抗氧化和抗炎活性。本课题主要通过MTT细胞活性检测,Western Blot,RT-qPCR等方法,使用TRAIL以及联用L-A刺激食道癌细胞系Eca109和TE1,研究L-A抗食管鳞癌的分子作用机制。结果显示,L-A增加食管癌细胞对TRAIL诱导细胞毒性的敏感性食管癌细胞Eca1 09和TE1表现出对不同浓度TRAIL诱导的细胞毒性作用的抗拒。之后检测L-A与TRAIL联合作用食管癌细胞的效应。实验数据表明,食管癌细胞发生明显的细胞死亡数量依赖L-A与TRAI共同作用时二者剂量改变。以HEK293细胞作为正常对照组,实验发现,TRAIL与L-A联合,对正常细胞HEK293不产生细胞毒性作用,正常细胞没有发生明显的死亡。L-A敏化食管癌细胞对TRAIL诱导的凋亡过程为验证是否食管癌细胞死亡数量增多是由于TRAIL与L-A协同作用进而增强TRAIL诱导的凋亡所致,我们采用AnnexinV/PI实验检测凋亡结果。数据显示用TRAIL和L-A联合处理的食管癌细胞Eca109的凋亡率显著高于单独用TRAIL处理的细胞(40.1%:23.1%)。TRAIL调控死亡受体DR4/5介导凋亡的分子机制已有报道,半胱天冬酶(Caspase)的激活是凋亡发生的中心机制。死亡受体通路是TRAIL诱导凋亡的主要途径,该途径由Caspase-8启动并最终激活效应物Caspase-3。通过实验,我们发现单独的5μM的L-A和50 ng/mL的TRAIL并不引起Caspase-3和PARP的变化,但联合处理后导致二者明显裂解。为进一步检测实验结果是否与治疗的时间顺序改变有关,我们在不同时段进行处理,发现实验结果与治疗顺序无关。随后用Caspase抑制剂z-VAD-fmk验证Caspase级联反应在TRAIL诱导凋亡中的作用。结果显示此抑制剂完全阻断TRAIL和L-A共同处理的食管癌细胞中Caspase-3,Caspase-8的活性和PARP的裂解。由此得出结论,L-A和TRAIL协同作用增强食管癌细胞Eca109和TE1的调亡。通过死亡受体DR4/5通路,L-A增强TRAIL诱导凋亡。L-A通过抑制Akt磷酸化增加食管癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性通过低剂量L-A在不同时间点处理Eca109细胞,结果显示相比Thr308片段,p-Akt在Ser473片段表达下调,而全长Akt保持不变。进一步研究发现,对照组细胞大多发生凋亡,Akt转染的细胞保持活性。提示Akt的减少与L-A剂量改变密切相关,并且L-A增强TRAIL诱导的凋亡是通过抑制Akt的活性实现的。L-A通过抑制XIAP表达增加食管癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性为进一步明确Akt在XIAP稳定性当中的作用,本研究使用Akt抑制剂渥曼青霉素,通过RT-qPCR的方法检测在经TRAIL处理后的细胞中XIAP的水平。结果显示,低剂量的L-A抑制Akt的Ser473片段磷酸化,不改变全长Akt水平,其结果与渥曼青霉素的作用一致。这种影响可以被野生型Akt转染的质粒清除。XIAP在没有转染的细胞中表达明显的下降而在Akt转染的细胞中保持稳定。显示时间-剂量依赖方式的TRAIL和L-A联合作用导致明显的XIAP下调。以上结果表明XIAP作为Akt底物,其表达下调,可增强L-A在TRAIL诱导的凋亡中的作用。L-A促进XIAP蛋白酶体降解为阐明其中的分子机制,我们首先采用RT-qPCR检测XIAP的mRNA水平表达,结果显示TRAIL和L-A不论个体还是二者联合并未改变XIAP蛋白的mRNA表达水平,提示XIAP主要是转录后调整。由此我们检测蛋白酶体抑制剂对XIAP蛋白影响。实验显示,抑制剂MG132消除由TRAIL和L-A诱导的XIAP的下调。此结果说明TRAIL和L-A促进XIAP蛋白酶体降解。通过以上研究发现,L-A通过抑制Akt蛋白的活化、下调XIAP蛋白促进TRAIL诱导的细胞凋亡,从而增强食管癌细胞对TRAIL诱导的细胞毒性的敏感性。本研究发现L-A增强由TRAIL诱导的食管癌细胞Eca109和TE1凋亡,为了解L-A抗癌的分子机制提供了一种重要的思路。L-A可能拓展肿瘤治疗的窗口,它可以杀死肿瘤细胞而对正常细胞起到保护作用。又由于Akt和XIAP在肿瘤形成中的重要作用,有助于认识L-A在治疗肿瘤中的重要性,结合我国中药抗肿瘤方面的优势,设计L-A与TRAIL结合治疗,发挥其协同作用,为那些对标准化疗无反应的食管癌患者提供一种可能的新型治疗策略,对常规食管癌化疗耐药患者的一种创新选择。