转基因技术出现以来，由此获得的转基因物种数量众多，转植基因在转基因动物PO代个体中的整合形式及位点多态性、多效性和杂交后代的遗传稳定性一直是转基因研究领域的热点，但目前尚未见关于转植基因在受体动物基因组精细定位的位置效应关系报道，转植基因产生功能的分子机理并不完全为人所知。与此同时，阐明转植基因的整合行为，提高转植基因的稳定整合效率和功能效应，又是所有转基因研究不可逾越和回避的关键问题，但已有的研究主要集中在分析外源基因在宿主基因组中整合的拷贝数与整合位点数。　　 尽管人们很早就发现大部分转植基因通过随机整合的方式，以串联体形式插入宿主基因组，可是，串连体的形成及其随机整合的机制一直困扰着人们，而且，由于转基因过程中，外源基因形成串联体的普遍性及在宿主基因组插入的随机性，极大地妨碍着转基因生物纯系的建立及同源基因打靶技术在转基因动物研究领域的应用。因此，阐明转植基因整合的分子机制不仅成为一个极富挑战性的研究课题，而且对于转基因动物研究的深入进行具有非常重要的理论意义和实际应用价值。　　 转基因技术在鱼类中的应用已过去20多年，但由于人们对转基因鱼生态安全的担忧，至今仍没有一例转基因鱼走向市场。尽管国内外众多实验室采用人工诱导三倍体鱼技术、倍间杂交培育三倍体鱼及反义转基因技术抑制鱼类性腺发育等多种策略培育出不育的转基因鱼，但是，上述策略仍然存在诸多不足之处，开发具有普遍意义的新型技术体系，抑制鱼类性腺发育，进而研制育性可控的转基因鱼，以从根本上解决转基因鱼的潜在生态风险，已成为转基因鱼研究领域亟待解决的关键问题之一。　　 因此，本论文根据本实验室的前期研究成果，以性腺完全败育的转反义sGnRH基因鲤鱼为研究对象，通过研究转植基因在宿主基因组中整合的旁侧序列信息，初步阐释了转植基因整合的分子机制，并通过分析转植基因及其非同源末端在斑马鱼中介导串连体形成的特性等，进一步证实有关转植基因整合的分子机制的新发现。与此同时，本论文确定了一个抑制鱼类性腺发育的新的靶向基因--DMC1(disruptedmeioticcDNA1)，开展了采用两系诱导调控系统研制育性可控的转基因鱼的探索研究，为研制育性可控的转基因鱼提供了新的研究思路，并为进一步建立鱼类育性可控的全新策略打下了基础。　　 本论文取得的具体研究结果如下：　　 1.分析转植基因在受体鱼基因组中整合的旁侧序列信息，在此基础上提出了转植基因整合的分子机制：非同源重组机制在转基因鱼外源基因的整合中起主导作用。以性腺发育被完全抑制的转反义sGnRH基因鲤鱼为试验材料，采用GenomeWalking及热不对称交错PCR(ThermalAsymmetricInterlacedPCR，TAIL-PCR)技术，分析了转植基因的整合位点及其旁侧顺序，研究分析了外源基因在受体鱼基因组中整合的机制，获得转植基因在受体鱼基因组中整合的旁侧顺序信息。发现绝大部分转基因之间形成串联体；具有完整连接处的串联体间粘性末端连接的特点一致，即一方被补平，而另一端则被切平，平端化后再发生串联，非同源重组机制在外源基因的整合中起主导作用。　　 2.以模式生物斑马鱼为研究对象，进一步证实所提出的转植基因整合分子机制的新发现。根据鲤鱼中分离得到的转植基因旁侧序列的特征，设计了重获荧光"gainoffluorescent”载体，在斑马鱼胚胎中观察NHEJ作用，并通过荧光强弱直接指示NHEJ的效率。采用7种不同内切酶组合消化载体，模拟细胞内DNA断裂时产生的不同末端，探讨NHEJ(non-homologousend-join)在加工外源基因DSBs(double-strandbreaks)中的机制。从发荧光的胚胎中分离获得转植基因在连接处的序列并通过分析其信息特征，进一步证实了我们依据转反义GnRH基因鲤鱼中转植基因整合信息而提出的关于外源基因的整合机制。我们的实验结果表明DNA断裂端的方式对DSBs的加工不存在影响，大约有53％的末端以补平的形式平端化后再被连接起来，这种连接方式表明DNA聚合酶以及连接酶在其中扮演了主要角色，很少一部分的序列出现了大片段的缺失，绝大部分缺失只发生在连接处两侧10bp以内，而极少数有几个左右的碱基插入。我们还在卵子破碎物以及未受精卵中研究了NHEJ介导转植基因串联的效率。　　 3.确定了抑制鱼类性腺发育与性成熟的新的靶向基因。分析了鱼类减数分裂相关基因DMC1在斑马鱼不同组织以及不同发育时期的表达模式，发现DMC1的表达模式与其他物种中的研究结果一致，DMC1只在成鱼的性腺中表达，在胚胎发育至仔鱼出膜几天后均不能检测到DMC1的表达，成熟未受精卵中检测到DMC1，但其在受精后2小时内就完全降解不能检测出来。根据DMC1的表达模式，我们选取DMC1作为抑制鱼类性成熟的靶向基因。首先构建了CMV启动子驱动的反义载体，获得转基因鱼，并与CMV　　 驱动的反义sGnRH载体转基因鱼组进行比较，分析其对配子成熟的作用，发现相比于反义抑制sGnRH基因的表达，反义抑制DMC1的转基因鱼P0代群体中向F1代传递报告基因eGFP的个体比例要明显少，表明DMC1可能在鱼类性腺发育与性成熟中起着非常重要的作用，可以作为研制育性可控转基因鱼的靶向基因。　　 4.提出了研制育性可控转基因鱼的新思路，初步建立了培育育性可控转基因鱼的新方法。对GAL4/UAS系统在斑马鱼中的应用可行性进行了研究。通过研究UAS驱动报告基因eGFP以及内源基因Chordin、Antivin在GAL4诱导下过表达的效率，并与T7系统相比较，我们确定GALA/UAS在斑马鱼胚胎中具有更高效的诱导表达能力。我们已经建立了UAS驱动DMC1的家系以及GAL4家系，并已得到性成熟的P0代个体，为研制新型育性可控的转基因鱼奠定了基础。