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食管癌是世界上最常见的消化系统恶性肿瘤之一,而我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家,其中,鳞癌是最多见的组织学类型,占90%以上。食管癌的发生和发展涉及多基因多阶段的改变,研究这些变化对阐明食管癌发病机制有重要意义。RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术,是指双链RNA(dsRNA)通过转录后的加工,特异性抑制目的基因mRNA生成,并导致特异性蛋白合成降低,以此来诱导细胞内同源序列的基因表达降低的现象,因此又被称作转录后的基因沉默(posttranscriptional gene silencing, PTGS)。RNA干扰的基本原理是：通过特异性dsRNA核酸酶裂解dsRNA,形成若干个长度为21-25bp的核苷酸,形成小的siRNA作为介导子,引起同源序列的特异性mRNA降解。siRNA技术不仅能够有效地使特异性的基因发生沉默,甚至可以替代基因敲除技术,它是目前研究基因调控功能的一个重要手段。RNA干扰的相关技术可用于抑制肿瘤细胞中异常基因的表达,使发生突变的基因恢复正常的生理功能,增加肿瘤细胞对现有治疗手段的敏感性,同时,我们还能通过研究各种作用因子的功能,从而筛选出治疗恶性肿瘤的有效的基因治疗的靶点。TPX2 (targeting protein for Xklp2)基因是近年来发现的一个候选的癌基因。国内外发表的期刊和杂志中已有多种体内、外实验均表明了,TPX2过表达可以导致细胞内中心体的扩增,出现DNA异倍体甚至多倍体,干扰细胞核正常分裂的完成并抑制其自身激活的生理途径,因而TPX2在细胞中的异常表达可能在细胞癌变以及恶性肿瘤发生发展中发挥重要的作用。已有外文文献证明TPX2基因在人类多种恶性肿瘤中如肺鳞状细胞癌、唾液腺癌、胰腺癌和卵巢癌中呈现高表达,但关于TPX2在食管鳞癌细胞中表达情况的报道却较为少见。本研究拟从以下几个方面进行研究：1、通过体外设计合成三种针对人类TPX2靶基因的siRNA(TPX2 siRNA988,TPX2 siRNA1042,TPX2 siRNA1725),分别转染高表达TPX2基因的食管癌EC9706细胞,探讨对食管癌EC9706细胞mRNA干扰效果最佳的有效转染位点和转染浓度；2、应用细胞增殖抑制试验法观察TPX2 siRNA对食管鳞癌EC9706细胞的增殖抑制影响,通过RT-PCR和Western blot技术检测对TPX2 mRNA和蛋白质表达的影响,探讨在不同的时间点干扰效果的差异。一材料和方法1.食管鳞癌EC9706细胞的培养：将食管鳞癌EC9706细胞置于含10%胎牛血清的1640培养基中,在37℃,5% C02,饱和湿度的细胞培养箱内进行贴壁培养。2.三条TPX2 siRNA的设计与合成：三种TPX2 siRNA(TPX2 siRNA-988,TPX2 siRNA-1042,TPX2 siRNA-1725)由中国上海吉玛制药技术有限公司设计并合成。3.转染：应用LipofectamineTM2000 Transfection Reagent将TPX2 siRNA转染到处于对数生长期的食管鳞癌EC9706细胞。4.最佳TPX2 siRNA的筛选：采用300 nM的转染浓度将三种siRNA转染到EC9706细胞48 h,分别设空白对照组和阴性对照组,用RT-PCR法检测转染后各组EC9706细胞中的TPX2 mRNA的表达情况。5.最佳siRNA浓度的筛选：采用终浓度为100 nM,200 nM和300 nM的TPX2siRNA-1725,转染细胞48 h,分别设空白对照组和阴性对照组,用RT-PCR法检测转染后各组EC9706细胞中的TPX2 mRNA的表达情况。6.最佳转染时间的筛选：采用终浓度为300 nM的TPX2siRNA-1725转染EC9706细胞24 h,48 h,72 h和96 h,设空白和阴性对照组,分别用RT-PCR法和Western blot法检测转染后各组EC9706细胞中的TPX2 mRNA和蛋白的表达情况,用MTT法检测各组细胞增殖抑制情况。7.统计方法：应用SPSS15.0统计软件进行统计学处理,资料数据均以均数±标准差(X±S)来表示,多样本均数比较采用单因素方差分析,方差不齐时先进行变量转换。α=0.05为显著性标准。二结果1.最佳TPX2 siRNA的筛选结果：三种TPX2siRNA以300 nM的浓度转染细胞48 h后,与空白对照组和阴性对照组相比,TPX2 siRNA-1725组的TPX2mRNA的表达水平下降明显,具有统计学意义(P<0.05)。因此,TPX2siRNA-1725为筛选出的最佳的TPX2 siRNA。2.最佳TPX2 siRNA-1725转染剂量的筛选结果：以终浓度为100 nM,200 nM和300 nM TPX2 siRNA1725分别转染细胞48 h,与空白对照组和阴性对照组(200 nM)相比,TPX2 siRNA-1725在转染终浓度为300 nM时,TPX2mRNA的表达水平下降最为明显,且具有统计学意义(P<0.05)。因此,筛选出的TPX2 siRNA-1725最佳的转染浓度为300 nM。3.最佳转染时间的筛选结果：以终浓度为300 nM的TPX2 siRNA-1725转染细胞24 h,48 h,72 h和96 h后,与对照组相比,TPX2 mRNA的表达在24 h开始受到抑制,至72 h时TPX2 mRNA表达最低(P<0.05)；与各对照组相比,EC9706细胞在转染后24 h其TPX2蛋白表达水平开始受到抑制,至72h时TPX2蛋白表达最低(P<0.05)；与各对照组相比,细胞在转染后48 h其增殖特性开始明显受到抑制,至72 h时抑制作用最为明显,生长抑制率为35.28%。4.TPX2 siRNA-1725体外瞬时转染食管癌EC9706细胞24 h,48 h,72 h和96 h后,其对TPX2蛋白表达的抑制效应和对TPX2 mRNA表达的抑制效应,呈正相关关系。三结论1.对化学合成的TPX2 siRNA采用RT-PCR和Western blot技术进行最有效干扰筛选,结果发现TPX2 siRNA-1725特异性的抑制TPX2表达的效果最佳。2.TPX2 siRNA-1725转染EC9706细胞后72 h,可使食管鳞癌EC9706细胞中TPX2 mRNA和蛋白的表达量明显降低,MTT实验表明转染TPX2siRNA-1725后可抑制食管癌细胞的增殖,提示TPX2特异性siRNA干扰可作为食管癌靶向治疗的手段。