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糖尿病胃运动功能障碍是糖尿病常见的一种慢性并发症,10年以上患者胃神经肌肉功能异常发生率高达30~50%,其主要特点是胃动力下降、排空迟缓,从而导致胃潴留。糖尿病胃动力障碍的发病机制目前仍不十分清楚。许多实验及临床观察表明,糖尿病存在着明显的胃电节律失常。目前认为慢波是胃肌电活动的起步电位,胃电慢波不论平滑肌处于静止或收缩状态时它都存在,虽然它不直接引起平滑肌的收缩,但与肌肉张力密切相关,慢波决定着胃收缩的频率、速度和方向,因而胃电活动与胃运动密切相关,胃电节律失常可导致胃运动异常。胃肠道慢波电活动分为控制性电活动和反应性电活动,控制性电活动起源于位于肠肌丛及和环行肌粘膜下边缘的cajal间质细胞。平滑肌细胞不仅对Cajal间质细胞引起的周期性去极化/复极化发生反应,产生反应性电活动,还是胃肠运动最基本条件,在慢波作用下,平滑肌细胞膜去极化,从而发生收缩反应。目的:本研究利用大鼠建立糖尿病模型,通过研究糖尿病大鼠胃窦Cajal间质细胞以及平滑肌细胞改变,了解糖尿病胃电节律失常发生原因以及胃窦Cajal间质细胞以及平滑肌细胞在糖尿病胃运动功能异常中的作用。材料与方法:健康Wistar大鼠随机分为糖尿病组和正常对照组2组。糖尿病组大鼠腹腔注射链脲菌素建立糖尿病模型,3月后记录胃电活动,测定胃排空,电镜观察大鼠胃窦cajal间质细胞形态,应用免疫组织化学技术观察胃窦c-kit、c-myc、c-fos以及c-jun阳性细胞的变化;western blotting方法测定c-kit、α-actin、c-myc、c-fos以及c-jun蛋白表达;流式细胞仪测定平滑肌细胞的凋亡率;RT-PCR方法测定SCF、calapinⅡ以及calpastatin mRNA的表达;激光共聚焦方法测定平滑肌细胞膜电位以及细胞内Ca2+。结果:1. 正常组大鼠慢波振幅较整齐,慢波频率变异系数为17.5%,异常节律指数为10%。糖尿病大鼠出现了明显的胃电节律失常,异常节律指数及慢波频率变异系数分别高达30.6%和23.5%,显著高于正常组(p分别<0.01及<0.05);给大鼠胃内灌注美兰<WP=13>测定胃排空,30min后糖尿病大鼠胃内美兰残留率为134.38±21.25%,明显高于正常对照大鼠胃内美兰残留率(100.00±16.46%,P<0.01),说明糖尿病大鼠胃排空明显延迟。2. c-Kit免疫组化染色显示大鼠胃窦c-Kit阳性细胞主要分布于环行肌层与纵行肌层之间的肌间神经丛周围,并形成网状结构, 在环行肌细胞之间也可见到少量c-kit免疫反应阳性细胞分布。糖尿病大鼠胃窦c-kit免疫反应阳性细胞数量明显减少,细胞分布稀疏,网络结构不完整。3. 电镜观察:糖尿病大鼠胃窦Cajal间质细胞与其他的Cajal间质细胞、平滑肌和神经末梢之间的缝隙连接均显著减少,尚存的细胞间连接的结构也有破坏,结构不清,连接松散;细胞的基膜结构不完整,缺乏连续性,有的基膜与细胞膜分离,形成空洞;细胞内的细胞器数量明显减少,线粒体肿胀、空泡样变、髓鞘样改变甚至溶解,内质网扩张,粗面内质网脱颗粒;细胞内的胞质广泛溶解,有大量的胞质内空泡形成,空泡大多沿质膜分布;核周间隙增宽。4. 正常大鼠胃窦平滑肌组织有一定程度的c-Kit蛋白表达,但在STZ诱发的糖尿病大鼠胃窦平滑肌组织c-Kit蛋白表达明显减少(861.95±76.32 vs 476.39±54.19, P<0.01)。RT-PCR结果显示:STZ诱发的糖尿病大鼠胃窦平滑肌组织SCF mRNA的表达明显低于正常大鼠(0.78±0.06 vs 1.12±0.1, P<0.01)。5. 糖尿病大鼠胃窦平滑肌细胞内Ca2+荧光强度为69.7±5.8,明显高于正常大鼠的57.2±4.9 (P<0.01)。与正常大鼠相比,糖尿病大鼠胃窦平滑肌细胞膜电位无明显变化,糖尿病胃窦大鼠平滑肌膜电位对氯化氨甲酰胆碱的反应性比正常大鼠敏感。6. 正常大鼠胃窦平滑肌组织α-actin蛋白光密度值为737.05±69.08,而糖尿病大鼠胃窦平滑肌组织α-actin蛋白光密度值仅为488.29±135.51,明显低于正常大鼠。糖尿病大鼠胃窦平滑肌细胞凋亡细胞百分率高达15%,明显高于正常大鼠的3%(P<0.01)。7. 正常大鼠胃窦平滑肌组织c-myc、c-fos及c-jun蛋白光密度值分别为370.19±38.92、476.73±48.26和423.91±52.82,而糖尿病大鼠胃窦平滑肌组织c-myc、c-fos及c-jun蛋白光密度值分别为687.14±49.22、785.61±48.05和844.26±90.65,均高于正常大鼠(P<0.01);糖尿病大鼠胃窦平滑肌组织c-myc、c-fos及c-jun阳性细胞也明显增多。8. 正常大鼠胃窦平滑肌组织有一定量的calpainⅡ和calapastatin mRN表达,但在糖尿病大鼠胃窦平滑肌组织,calpainⅡ mRNA表达明显增加(正常对照为0.51±0.05 vs 糖尿病组0.63±0.05, P<0.01);而calapastatin mRNA的表达明显减少(正常对照为0.47<WP=14>±0.04 vs糖尿病组0.37±0.05, P<0.01)。结论:1. 正常大鼠胃窦Cajal间质细胞主要分布于环行肌层与纵行肌层之间的肌间神经丛周围,并形成网状结构,在环行肌细胞之间也有少量细胞分布。糖尿病大鼠胃窦平滑肌细胞膜电位无明显改变,而Cajal间质细胞数量减少、细胞发生变性,提示糖尿病胃电节律失常主要是Cajal间质细胞病变所致。2. SCF-Kit信号途径对出生后Cajal间质细胞发育、形态及功能的维持相当重要,SCF-Kit系统受损与糖尿病大鼠胃窦Cajal间质细胞变性、数量减少以及网络结构破坏有关,最终导致胃运动障碍?