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乙肝表面抗原(HBsAg)是乙肝疫苗的主要有效成分。利用酿酒酵母表达重组乙肝表面抗原已成为制备基因工程乙肝疫苗的主要途径。本论文利用基因工程技术，将优化的乙肝表面抗原基因在酿酒酵母中进行异源表达，分别从转录水平、翻译水平以及翻译后水平进行优化，显著提高HBsAg的表达活性；并通过摇瓶发酵优化进一步提高HBsAg在重组酿酒酵母中的表达水平。本论文主要研究内容如下：在酿酒酵母中利用TEF1启动子实现HBsAg的异源表达。将HBsAg基因序列按照酿酒酵母密码子偏好性进行优化并合成，构建重组表达载体及相应重组菌。发酵后检测HBsAg活性。结果显示，HBsAg活性为9.82IU g-1干重，表明在酿酒酵母中利用组成型强启动子TEF1成功实现HBsAg的异源表达，且产物具有免疫活性。为了简化产物的纯化，比较了在N端和C端分别添加6×His纯化标签时HBsAg的表达，发现在C端添加His标签对HBsAg表达的影响较小(HBsAg活性降至8.87IU g-1干重)。通过筛选启动子、优化kozak序列、筛选信号肽及共表达PDI分别从转录、翻译和翻译后水平进行优化，使HBsAg活性从初始的8.87IU g-1干重提高至186.11IU g-1干重，提高了20倍。(1)分别利用酿酒酵母组成型的TEF1、TDH3、HXT7、ADH1及诱导型的GAL1五种启动子表达HBsAg，发现GAL1最适合表达HBsAg (46.45IU g-1干重)，较启动子TEF1提高了3.87倍。(2)将GCCACC、TACACA和AAAAAA三种kozak序列分别用于HBsAg的表达，发现序列TACACA最有利于HBsAg的表达(63.67IU g-1干重)，使活性提高37%。(3)尝试利用应用广泛的酿酒酵母α-factor信号肽、专利报道分泌效率很高的酿酒酵母ybr187w信号肽及南极假丝酵母脂肪酶B的信号肽nsB分别引导HBsAg实现分泌时，均未能成功分泌HBsAg，但发现添加nsB信号肽能促进HBsAg的表达(83.56IU g-1干重)，使活性提高31.24%。(4)将蛋白质二硫键异构酶PDI与HBsAg进行共表达，使HBsAg活性进一步提高了1.23倍，为186.11IU g-1干重。对最优重组菌进行摇瓶发酵优化，使HBsAg活性提高了75.2%。为了进一步提高HBsAg的表达水平，在摇瓶水平上，分别对培养条件、培养基组成、添加剂进行优化，优化后的发酵条件为温度30℃、初始pH5.0、装液20mL (250mL摇瓶)、初始OD600为0.5、发酵72h；优化的培养基组成为(g L-1)：半乳糖15、葡萄糖25、胰蛋白胨20、酵母粉10；添加甘油4g L-1和蔗糖6g L-1；经过发酵优化，HBsAg活性提高了75.2%，从185.93IU g-1干重提高至325.75IU g-1干重，实现了HBsAg在酿酒酵母中的较高水平表达。