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结核病目前仍是严重威胁人类健康的严重传染性疾病之一,在2008年约有940万新发结核病病例,180万人死于结核病,卡介苗虽然到目前仍是人类应用最为广泛和最早的疫苗之一,而且在预防儿童血行播散性结核中也卓有成效,但在预防成人肺结核病中其保护效力却被证实差异巨大(0-80%)。各种旨在研发增强或替代卡介苗的新型疫苗的研究在世界各地广泛的展开。找出可以诱导机体保护性免疫的结核分枝杆菌蛋白、多肽是研发各种新型疫苗的基础。在人体针对结核病的免疫反应中,细胞免疫被认为起主要的保护性作用,人体CD4+和CD8+T细胞通过介导自身或其它免疫细胞分泌γ-干扰素、肿瘤坏死因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等效应因子及细胞毒性作用来消灭入侵的结核分枝杆菌和感染的细胞。而结核分枝杆菌的抗原是通过与MHC分子结合来激活和提呈给CD4+和CD8+T细胞的。因此在寻找具有保护性免疫原性的抗原时,其肽段是否和MHC分子具有高亲和性就是一个重要的标准。在结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列测序公布后,其中有两个基因家族因其编码蛋白的N端富含脯氨酸-谷氨酸(Pro-Glu),脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸(Pro-Pro-Glu)的基序,所以被命名为PE和PPE家族基因,它们是一组富含甘氨酸和丙氨酸的蛋白,在分枝杆菌基因组3924个开放阅读框中确占有大约8%的编码份额,其家族蛋白被认为和结核分枝杆菌的抗原性变异相关,成员多为细胞表面蛋白,也有分泌性蛋白,家族中有多个成员被证实可以诱导机体保护性免疫。它们在结核分枝杆菌基因组中占据如此大的份额,绝大多数成员的功能尚未明确,且在已被研究的成员中,它们表现出功能的多样性,有可以诱导细胞免疫的成员,也有可以诱导体液免疫的成员,因此对其家族成员免疫原性的研究具有很大的价值。近年来随着生物信息工具的算法和数据库的快速更新,我们使用多种生物信息学软件对其进行了分泌性和抗原性的分析。从英国Sanger研究所网站下载分枝杆菌H37Rv的全基因组信息(http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis/),提取PE和PPE家族全部168个蛋白序列。然后使用SignalP, Secretome, DAS, NetMHC等生物信息学工具顺序分析预测PE、PPE家族蛋白中可能的分泌性蛋白及其包含的与MHC分子具有高亲和力的肽段。选择合成其中的一部分肽段,将其和结核病人外周血单核细胞(PBMC)共同孵育,检测其是否能刺激外周血单核细胞分泌γ-干扰素,初步研究其家族部分蛋白多肽的免疫原性。具体实验内容和步骤如下:1.获取结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列:我们从英国Sanger研究所网站(http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis/)下载结核分枝杆菌H37Rv的全基因组序列,使用Sanger研究所推荐的Artemis软件浏览并提取PE和PPE家族全部168个蛋白序列。2.对所有168个蛋白序列顺序经过SignalP(信号肽分析工具),Secretome(非信号肽方式分泌性蛋白分析工具),DAS(蛋白跨膜结构分析工具),NetMHC(蛋白与MHC分子亲和力分析工具)工具进行分析,使用SignalP,Secretome和DAS筛选出PE和PPE家族可能的分泌性蛋白,然后通过NetMHC预测这些可能的分泌性蛋白和MHC分子具有高亲和力的肽段。基本过程如图1和图2。图1.SignalP和DAS预测分泌性蛋白及抗原性分析流程。3.根据NetMHC分析结果,结合东亚人群中HLA表型分布频率,我们选择合成了6个肽段Peptide1-6,它们被预测和HLA0201、HLA2401或HLA5801具有高的亲和力。将其稀释至工作浓度,与结核病人外周血单核细胞共同孵育,使用人γ-干扰素ELispot试剂盒检测其刺激PBMC分析γ-干扰素的水平。4.Peptide1-6经人γ-干扰素ELispot检测试剂盒检测,其均可诱导结核病人PBMC分泌γ-干扰素,其中Peptide2、4、6有较强的诱导γ-干扰素分泌作用,Peptide1、3、5诱导的γ-干扰素分泌则较弱。课题研究结果初步证明结核分枝杆菌PE、PPE家族蛋白经过生物信息学分析选择性合成的多肽Peptide1-6可在不同程度上诱导PBMC分泌γ-干扰素,说明其具有诱导机体对结核分枝杆菌产生保护性免疫的潜力,也表明多肽对应的PE、PPE家族成员蛋白可能诱导机体保护性免疫。进一步证明了PE和PPE家族成员确有做为结核分枝杆菌疫苗或亚单位疫苗的可能。