膜性肾病,占原发性肾病综合征的20-35%,是成人肾病综合征的首要原因,严重影响病人的生活质量。尽管在一部分病例中膜性肾病是一种发展温和、能够自发缓解的疾病,然而,仍然有40%的膜性肾病病人最终会发展至终末期肾脏病。膜性肾病的特征性病理改变是足细胞损伤和免疫复合物沉积引起的基底膜增厚。足细胞是肾小球基底膜外的一层终末分化细胞,它是免疫复合物介导的以及非免疫因素引起的肾脏损伤的靶点。尽管膜性肾病的病因不十分清楚,但通常认为它是自身抗体与靶抗原形成免疫复合物沉积在上皮下,继而激活补体,引起足细胞损伤和蛋白尿。CXCL12(C-X-C趋化因子配体12)是趋化因子家族成员,通过趋化因子受体CXCR4(C-X-C趋化因子受体4)发挥生物学作用。文献报道,CXCL12在肾脏相关疾病中发挥作用。Sayyed等发现,阻断CXCL12能够抑制糖尿病肾病的巨噬细胞聚集。Balabanian等发现CXCL12参与了狼疮性肾炎的进展,并且抗CXCL12能够抑制肾小球肾炎的进展。虽然CXCL12在足细胞中也有表达,但它在膜性肾病发展进程中的可能的生物学作用目前尚未有报道。STAT3(信号转导与转录激活因子3)是一个信号转导因子,是转录蛋白家族的一个激活剂。它的生物学功能多种多样,包括细胞增殖、分化、存活以及血管的发生。STAT3能够被很多细胞因子激活,比如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)。据报道,STAT3信号通路在大鼠和人类的肾小球肾炎中是被激活的。在HIV感染引起的塌陷性肾小球疾病中,激活的STAT3能够促使足细胞增生和去分化。除此以外,当CXCL12发生变化时,相应地CXCR4能激活JAK/STAT3信号通路。在CXCL12处理过的乳腺癌细胞中,P-STAT3表达明显增加,这表明P-STAT3可能是CXCL12的下游因子。C5b-9是一种高分子膜攻击复合物。C5b-6与C7、C8和C9共同形成C5b-9复合物,它能够插入到细胞膜的磷脂双层,在细胞膜上形成通道或者漏孔,导致无核细胞死亡,有核细胞比如足细胞则引起细胞损伤。C5b-9通过(转化生长因子-β)TGF-β、(血管紧张素Ⅱ)AngⅡ或者(活性氧)ROS攻击足细胞引起足细胞损伤,并进而引起膜性肾病的发生和发展,最终导致终末期肾病。在本研究中,我们通过ELISA方法检测,观察到膜性肾病病人的血清和尿液中CXCL12的水平增高,这意味着,在膜性肾病中,CXCL12可能是一个有用的诊断性生物学标志物。接下来我们用三种不同浓度的C5b-9诱导足细胞损伤,通过细胞活性检测发现,C5b-9抑制足细胞增殖具有浓度-时间依赖性。因此,最终我们选定0.4 μg/mL的C5b-9来诱导足细胞损伤。在这个足细胞损伤的模型中,我们观察到CXCL12 SiRNA抑制CXCL12能够减少细胞凋亡,同时CXCR4/P-STAT3/半胱天冬酶3和TNF-α/IL-6也下降。除此以外,STAT3磷酸化抑制剂AG490和CXCL12的拮抗剂berberine对CXCL12处理过的足细胞也有保护作用。因此,我们得出结论,CXCL12在膜性肾病中具有重要的作用,它有可能成为一个新的诊断性靶点,甚至用来治疗肾脏相关的疾病。第一部分特发性膜性肾病病人血、尿的CXCL12检测目的:了解特发性膜性肾病病人的血、尿CXCL12的水平。方法:1收集90例特发性膜性肾病和90例健康对照者的血和尿液标本;2通过ELISA方法检测血、尿CXCL12的浓度。结果:相对于健康对照组,膜性肾病病人血和尿的CXCL12的浓度明显增高(P<0.05)。结论:CXCL12可能参与了膜性肾病的发生发展。第二部分C5b-9复合物诱发足细胞损伤模型的建立和它对CXCL12/CXCR4及下游因子的影响目的:1用C5b-9复合物建立足细胞损伤模型;2寻找最适合的C5b-9复合物浓度;3观察在足细胞中C5b-9复合物对CXCL12/CXCR4及下游因子的影响。方法:1足细胞培养2培养的足细胞分组:空白组0.05μg/mL C5b-9 组0.1g/mL C5b-9 组0.2μg/mL C5b-9 组0.4μg/mL C5b-9 组3通过CCK8检测细胞增殖活性;4 用 Western BLot 方法检测 CXCL12、CXCR4、STAT3、P-STAT3 的表达。结果:1通过CCK8检测,C5b-9复合物作用足细胞后,足细胞增殖活性降低;2C5b-9复合物对足细胞增殖活性的抑制,随C5b-9浓度增高作用时间延长而增强;3C5b-9复合物处理细胞后,CXCL12、CXCR4、P-STAT3的表达明显增加,而STAT3不变。结论:1成功建立C5b-9复合物诱发足细胞损伤模型;2选定0.4 μ g/mL作为C5b-9复合物诱发足细胞损伤模型的浓度;3CXCL12、CXCR4、P-STAT3可能参与了 C5b-9复合物诱发的足细胞损伤。第三部分CXCL12对足细胞的损伤是通过激活CXCL12/p-STAT3信号通路目的:通过应用p-STAT3阻断剂和CXCL12的拮抗剂进一步研究CXCL12/STAT3信号通路。方法:1足细胞分组:空白组CXCL12 组CXCL12+AG490 组CXCL12+berberine 组2流式细胞检测足细胞凋亡;3 Western BLot 方法检测 CXCL12、CXCR4、STAT3、P-STAT3、caspases3 的表达。结果1加入CXCL12的足细胞凋亡明显增加,凋亡相关蛋白caspases3的表达增加;2 CXCL12处理足细胞后,CXCR4、P-STAT3的表达明显增加;3 AG490明显抑制CXCL12引起的足细胞凋亡及凋亡相关蛋白caspases3的表达;4 AG490明显抑制CXCL12引起的足细胞CXCL12、CXCR4、P-STAT3的表达;5 berberine明显抑制CXCL12引起的足细胞凋亡及凋亡相关蛋白caspases3的表达;6 berberine明显抑制CXCL12引起的足细胞CXCL12、CXCR4、P-STAT3的表达。结论:CXCL12对足细胞的损伤是通过激活CXCL12/p-STAT3信号通路。第四部分SiRNA序列的选择及它对足细胞CXCL12的影响目的:1观察SiRNA转染后,对足细胞CXCL12的作用;2选择抑制效率最高的SiRNA序列。方法:1根据CXCL12 mRNA,设计三种SiRNA,同时一种乱码的SiRNA做阴性对照;2脂质体介导SiRNA转染;3足细胞分组:空白组乱码SiRNA组SiCXCL12-1 组SiCXCL12-2 组SiCXCL12-3 组4通过RT-PCR方法检测CXCL12 mRNA水平;5通过Western Blot方法检测CXCL12的表达。结果:1SiRNA转染后,CXCL12 mRNA水平较空白对照组及阴性对照组,明显降低;2SiRNA转染后,CXCL12蛋白表达较空白对照组及阴性对照组,明显降低。结论:根据对CXCL12的抑制效率,选择第三种序列作为后续使用。第五部分CXCL12 SiRNA对C5b-9诱导的足细胞损伤的保护作用及作用机制目的:1观察CXCL12 SiRNA转染对C5b-9诱导的足细胞的作用;2探讨CXCL12 SiRNA转染对C5b-9诱导的足细胞的保护作用机制。方法:1足细胞分组:C5b-9组C5b-9+乱码 SiRNA 组C5b-9+CXCL12 SiRNA组2 CCK8检测足细胞增殖活性;3流式细胞检测细胞凋亡;4 用 ELISA 方法检测 CXCL12、TNF-α、IL-6;5 Western BLot方法检测 CXCL12、CXCR4、STAT3、P-STAT3、caspases的表达。结果:1与空白组及阴性对照组相比,转染CXCL12 SiRNA明显促进细胞增殖;2与空白组及阴性对照组相比,转染CXCL12 SiRNA明显抑制细胞凋亡;3CXCL12 SiRNA减少细胞上清液中CXCL12、TNF-α、IL-6的含量;4CXCL12 SiRNA 减少 CXCL12、CXCR4、P-STAT3、caspases3 的表达。结论:1CXCL12 SiRNA对C5b-9诱导的足细胞损伤有保护作用;2CXCL12 SiRNA对C5b-9诱导的足细胞损伤的保护作用是通过抑制CXCL12/CXCR4/P-STAT3 实现的。