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目的:骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,好发于10～20岁的青少年,恶性程度高,预后差[1],手术和化疗在临床治疗骨肉瘤提高患者生存期中发挥着重要和关键的作用[2]。但是,在骨肉瘤复发患者的化疗中发现存在高的失败率和较低的中位生存率[3]。研究骨肉瘤化疗机制对骨肉瘤的治疗和提高病人的生存率是非常必要的。吡柔比星已临床用于治疗骨肉瘤,而紫杉醇只作为治疗骨肉瘤的二线用药而且应用不如吡柔比星[4]。目前已有吡柔比星和紫杉醇在临床上联合应用的报道[5?7]。然而,很少有对化疗药物诱导骨肉瘤细胞凋亡的分子机制的研究。因此,为了找到更加合理和有效的综合治疗方案,本实验研究了吡柔比星和紫杉醇诱导凋亡活性的分子机制。方法:将MG-63细胞置于37℃,饱和湿度5%CO2的10%DMEM培养基中常规培养,待细胞进入对数生长期后用于实验。1光镜观察:将不同浓度的紫杉醇和吡柔比星作用于MG-63细胞,在倒置相差显微镜下定时观察细胞的生长情况并照相。2 MTT实验:调整细胞浓度为5×104/ml,以每孔200ul培养于96孔培养板中,进入对数生长期后采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度紫杉醇(10、102、103、104nmol/L)和吡柔比星(102、103、104、105nmol/L)对细胞的生长抑制作用。3流式细胞仪检测细胞周期:采用不同浓度的紫杉醇和吡柔比星作用MG-63观察对照组(不含药)和102nmol/L紫杉醇组和103nmol/L吡柔比星组作用时间分为12h、24h、48h和72h后收集细胞。收集细胞1000r/min离心5min,调整浓度为5×106个,用PBS洗一次,离心去上清;加入冰预冷的70%的乙醇固定,4℃放置1h,离心后去固定液,用3mlPBS重悬5min后1000r/min离心5min,弃上清;加入碘化丙锭(Propidium Iodide,PI:50mg/L Trinton X-100 1.0%)室温避光染色30min,用Epics-XLⅡ型流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布,应用软件进行分析。4 Western印迹法观察紫杉醇及吡柔比星作用后的人成骨肉瘤细胞MG-63的PCNA、cyclinD1、cyclinE、Bcl-2、Bax的表达。结果:(1)倒置相差显微镜下观察可见经102nmol/L紫杉醇处理MG-63细胞12h后,细胞折光变强,部分细胞体积变小变圆,24h后细胞开始皱缩,贴壁能力差,细胞体积更小,少量细胞漂浮,48h后细胞体积普遍变小,胞质浓缩,大量细胞变圆漂浮,72h后大部分细胞变圆,失去增殖能力漂浮于液体中,出现明显的药物抑制现象。103nmol/L吡柔比星作用12h后细胞增值数量减少,细胞体积增大胞膜破裂胞质外溢,细胞坏死漂浮,24h后分裂期细胞少见,胞膜破裂细胞坏死,漂浮细胞增多,48h后大部分细胞形态不规则,体积增大,坏死漂浮,存活细胞颜色晦暗,生长停滞,72h后漂浮坏死细胞明显增多。(2)不同浓度(10、102、103、104nmol/L)紫杉醇和不同浓度(102、103、104、105nmol/L)吡柔比星作用于MG-63细胞12h、24、48、72h,MTT结果显示紫杉醇和吡柔比星均能明显抑制MG-63细胞增殖,并呈剂量和时间依赖性(p<0.01)。(3)FCM分析发现,不同浓度(10、102、103、104nmol/L)紫杉醇处理细胞24h及相同浓度(102nmol/L)紫杉醇处理细胞12h、24h、48h、72h后,G0/G1期前面出现凋亡峰,G2/M期所占比例随药物浓度和时间增加呈上升趋势,而G1期所占比例呈递减趋势。不同浓度(10、102、103、104、105nmol/L)吡柔比星处理细胞24h及相同浓度(103nmol/L)吡柔比星处理细胞12h、24h、48h、72h后未见明显凋亡峰出现,S期所占比例随药物浓度和作用时间增加呈上升趋势。(4)western-bloting结果:经紫杉醇和吡柔比星处理过的骨肉瘤细胞与对照组相比均表现出PCNA、cyclinD、cyclinE和Bcl-2蛋白表达抑制,Bax蛋白表达增强。结论:(1)紫杉醇和吡柔比星均对骨肉瘤细胞MG-63存在抑制细胞增殖作用且具有时间-剂量依赖关系。随时间延长不同浓度吡柔比星对细胞的最终抑制作用是一致的。凋亡峰最高时的浓度可能是最适浓度。低浓度紫杉醇长时间和高浓度紫杉醇短时间对细胞抑制作用一致。浓度和时间不是很重要的选择,凋亡峰最高的时间和浓度效果最佳。(2)紫杉醇对骨肉瘤细胞MG-63显示出G2/M阻滞作用,并且有一定的时间-剂量依赖性,使细胞周期受到阻滞,并进一步诱导其凋亡。吡柔比星在细胞增殖周期中阻断细胞进入G2期,使细胞停滞于S期,抑制DNA合成干扰细胞分裂。在一定范围内存在时间-剂量依赖性且对剂量关系更密切。不同浓度紫杉醇作用骨肉瘤细胞后G0/G1期比例整体呈下降趋势,表明紫杉醇对细胞增殖周期的G0/G1期存在阻断作用,具体机制有待进一步研究。不同浓度吡柔比星作用骨肉瘤细胞后细胞G0/G1比例呈先下降后上升趋势,表明吡柔比星对骨肉瘤细胞增殖周期G0/G1期延缓作用。(3)如果S期过大时停药可导致肿瘤细胞继续分裂,且分裂很快,如果是G2/M期,停药后细胞很快进入S期。细胞被阻滞于G0期是最有效的。浓度过低时未见明显凋亡峰说明药物只杀伤正常细胞达不到杀伤肿瘤细胞的目的。浓度过高时仍无明显凋亡峰出现,表明浓度过高时凋亡较少且相对副作用较大。只有合适有效浓度时,即凋亡峰明显时达到杀伤肿瘤细胞的目的。吡柔比星还可能通过破坏骨肉瘤细胞MG-63细胞膜的结构和功能直接杀死细胞。(4)紫杉醇可与吡柔比星联合应用治疗骨肉瘤。