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精子克隆胚的激活是克隆胚发育的关键步骤之一,重构胚激活效率的高低直接影响胚胎发育率和囊胚率。核移植胚胎的起始发育依赖于重构胚的有效激活,近年来随着核移植激活技术的进步,核移植效率不断提高。精子克隆胚不同于体细胞克隆胚,由于遗传物质全部来源于父本,因而其激活方法与常规体细胞克隆有差别。同时,针对精子克隆的特点,对激活方法进行适当的改进,也是非常必要的。因此,在牛双精子克隆胚激活方法上的研究对于完善双精子克隆技术有着重要的实用价值和理论意义。本实验以体外成熟的牛卵母细胞和1019牛冻精为材料,通过显微操作去核、注入两个精子形成双精子克隆胚,2h后以Ionomycin、A23187、6-DMAP、CB为人工刺激条件,单一激活和联合激活为基本激活方法,以重构胚的卵裂率和囊胚率为检测指标,研究不同激活方法对双精子克隆胚激活效果的影响,并选定卵母细胞去核后、注射双精子前进行预激活,以寻找一种牛精子克隆较好的人工激活方法,为提高牛双精子克隆技术的成功率提供技术参考。主要内容和结果如下：试验一,钙离子载体A23187浓度和激活时间对精子克隆效果的影响：将休整2h的牛双精子克隆胚分别放到不同浓度(0.05μM、0.1μM、0.15μM)钙离子载体A23187的SOF中处理1min、5min、10min,然后再转移到不含A23187的SOF中继续培养,观察卵裂率和囊胚率。结果表明：钙离子载体作用时间对卵裂率有显著影响(P<0.05),随作用时间的延长,早期胚胎发育率先增后减,当作用时间超过5min时,胚胎发育率开始下降；作用时间对囊胚率无显著影响(P>0.05)。从浓度方面看,钙离子载体A23187浓度对早期胚胎发育有显著的影响(P<0.05),处理时间相同,浓度越大,卵裂率越高；低浓度时无论作用时间长短,卵裂率均不高,高浓度时随作用时间延长,卵裂率显著下降。低浓度时,无囊胚产生,浓度在0.1μM和0.15μM时,仅获得少量囊胚。试验二,6-DMAP浓度对精子克隆胚激活效果的影响：在试验一结果的基础上,采用Ionomycin+6-DMAP、A23187+6-DMAP的激活方法,比较不同浓度6-DMAP对激活效果的影响。A23187浓度为0.1gM,激活5min; Ionomycin浓度为5μM,激活5min,A23187和Ionomycin激活5min后,再置入不同浓度(1 mM/L、2 mM/L、4 mM/L、6 mM/L)6-DMAP中激活4h。试验结果表明：当6-DMAP浓度小于4mM/L时,随着浓度的增加,激活效果增强,重构胚的发育率增加。当6-DMAP浓度大于4 mM／L时,随着浓度的增加,重构胚的卵裂率和囊胚率逐渐下降。选择A23187+6D的激活方法,当6D浓度时4 mM／L时,激活效果最好,对比Ion+6-DMAP与A23187+6-DMAP的激活方法,当6-DMAP浓度都是4 mM／L时,A23187+6-DMAP对重构胚的卵裂率和囊胚率分别是18.2%、10.9%,卵裂率高于Ion+6-DMAP的16.1%,而囊胚率较低。试验三,激活液中添加细胞松弛素(cytochalasin B, CB)对精子克隆胚激活效果的影响：重构胚经过添加CB的激活液处理后,卵裂率和囊胚率均显著高于未经CB处理的重构胚的卵裂率(P<0.01)和囊胚率(P<0.05)。利用A23187+6-DMAP+CB的激活方法处理克隆胚,所得卵裂率大于Ionomycin+6-DMAP+CB组(P<0.01),但囊胚率不如Ionomycin+6-DMAP+CB组。这些结果表明：用Ionomycin+6-DMAP+CB激活精子克隆胚可以获得较高的囊胚率；用A23187+6-DMAP+CB激活克隆胚可以获得较高的卵裂率。试验四,预激活去核卵母细胞对克隆胚激活效果的影响：激活组和对照组的卵裂率分别为12.5%和21.7%,后者高于前者,差异极显著(P<0.01),两组囊胚率分别为5.0%和8.7%,后者也高于前者,差异显著(P<0.05)。以上说明试验中不采用预激活的去核卵母细胞作精子受体可以获得较好的胚胎发育效果。