猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)EO糖蛋白既是包膜蛋白，又是一种核酸酶，其活性对病毒在宿主体内的持续感染有直接关系。鉴于EO蛋白在病毒感染，诱导机体免疫及与宿主细胞相互关系中的作用，本研究克隆了2株猪瘟病毒EO基因并将其与其它毒株EO基因进行了序列分析，揭示了我国猪瘟病毒流行株之间的遗传演化关系，为猪瘟病毒的流行病学研究提供依据。同时将兔化弱毒株EO基因分别置于原核与真核表达系中进行了表达，并对重组蛋白进行了初步的免疫学分析。 首先，采用RT-PCR和nest-PCR技术扩增了CSFV-JL株和CSFV-LN9912株EO基因，插入T easy载体后测序，应用DNAStar5.0和Bioedit软件将其与本实验室已测其它毒株和GeneBank中登录的CSFV代表毒株EO基因序列进行比较，绘制了遗传进化树并预测了EO蛋白的抗原表位、疏水性、等电点等特性。序列分析结果表明本实验室所测毒株可分为两群，15株CSFV EO基因RNase活性的两个氨基酸基序SLHGIWPE(或G)(28-36位)和EWNKHGWC(75-82位)高度保守，仅5个疫苗株SLHGIWPE基序中的E替换为G，基序中位于30和79位的H为RNase催化活性关键氨基酸残基，高度保守。 其次，将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)EO基因分别插入pGEX4T，pET30，pMAL-p2X中，并分别构建了以BL21和BL21(DE3)codon plus,BL21(DE3)和BL21(DE3)codon plus,TB1和BL21(DE3)codon plus为宿主菌株的原核表达系。通过摸索IPTG诱导浓度，诱导温度，菌体收获时间等条件，确定了EO基因能在pGEX4T／BL21(DE3)codon plus和pMAL-p2X／BL21(DE3)codon plus中高效表达，表达产量分别占菌体总蛋白的15％和30％，表达的重组蛋白主要为包涵体。分别采用B-per试剂和超声波裂解配以曲通-尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果。使用分步透析法对变性的包涵体进行复性，将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-EO融合蛋白。以GST-EO融合蛋白为诊断抗原，初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清EO抗体的方法。 此外，为了得到可溶性重组EO蛋白并便于观察重组蛋白的表达情况，我们将EGFP基因与EO基因相连插入昆虫杆状病毒转移载体中，与线性杆状病毒DNA共转染sf9细胞后通过噬斑纯化得到纯的重组杆状病毒，将其感染sf9细胞制备P1种子液，同时用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况剔除表达效果差的重组杆状病毒。再用P1种子液感染sf9细胞制备高效价的P2种子液。通过病毒液的梯度稀释和噬斑测定，确定P2种子液的病毒滴度达1.14×10~7pfu／ml。将P2种子液以MOI 5-10接种指数期sf9细胞，三天后呈现出最强的荧光。 我们还将EGFP-EO融合基因插入哺乳动物细胞表达载体pCI-dhfr中，构建重组质粒pCI-dhfr-EGFPEO。将重组质粒转染CHO(dhfr~-)，通过一轮MTX加压筛选后，荧光显微镜下观查到少量细胞呈现绿色荧光。重组融合蛋白在昆虫细胞和CHO细胞中的初步表达为进一步大量制备可溶性的EO糖蛋白，研究其生物学功能奠定基础。