研究目的：　　近年来，原发性肝癌的发病率不断提高，且呈年轻化趋势。肝癌的恶性程度高，进展迅速，多数病人确诊时已是处于肝癌中晚期或治疗后复发，而中晚期肝癌或复发的患者缺乏有效的治疗方法，且治疗效果欠佳。随着肿瘤学和免疫学的发展，肝癌的免疫治疗成为当前的研究热点之一。自然杀伤细胞（NK细胞）对肿瘤细胞有免疫清除和免疫监视的功能，被认为是肿瘤免疫治疗过程中的重要效应细胞之一。文献报道，IL-2等多种细胞因子能促进NK细胞的增殖、分化及增强NK细胞的细胞活性，而其中以IL-2和IL-15的效果最为显著，但常用的加入IL-2体外扩增获得的NK细胞的纯度及活性仍欠理想。既往研究发现原发性肝癌患者外周血中NK细胞的杀伤率、NK细胞表面NKG2D受体的表达率显著降低，而提高NKG2D受体的表达水平可能有助于增强肝癌的过继免疫治疗。因此，本研究通过免疫磁珠分选法分选纯化CD3—CD56+CD16+NK细胞，用IL-2、IL-15、SCF三个细胞因子联合诱导NK细胞，观察经IL-2/IL-15/SCF诱导的CD3—CD56+CD16+NK细胞体外扩增能力、NK细胞表面NKG2D表达变化，用NKG2D单克隆抗体封闭NKG2D，观察其对不同肝癌细胞株的杀伤作用。　　研究方法：　　抽取健康成年人外周血，应用密度梯度离心法从健康人外周血中分离得到外周血单个核细胞悬液，使用流式细胞术检测纯化前健康人外周血单个核细胞中CD3_CD56+CD16+NK细胞的纯度，用免疫磁珠分选法分离出高纯度的CD3_CD56+CD16+NK细胞，使用流式细胞术检测纯化后CD3TD56+CD16+NK细胞的纯度。在含有纯化后的CD3—CD56+CD16+NK细胞的培养基中加入细胞因子IL-2、IL-15、SCF组成不同的细胞体系进行实验分组，分为空白对照组（不添加任何细胞因子的NK细胞组）、IL-2组（加入含终浓度为500U/mlIL-2的NK细胞组）、IL-15组（加入含终浓度为20ng/mlIL-15的NK细胞组）和IL-2/IL-15/SCF组（加入含终浓度为500U/mlIL-2、20ng/mlIL-15和100U/mlSCF的NK细胞组）。使用台盼蓝染色计数法分别计数免疫磁珠分选后及培养14天后各实验组CD3_CD56+CD16+NK细胞的数目，比较其扩增倍数变化，以及用流式细胞仪检测免疫磁珠分选后及培养14天后各实验组NKG2D的表达差异。以各实验组CD3—CD56+CD16+NK细胞为效应细胞，HepG2、SMMC-7721细胞为靶细胞，按效靶比为10:1，应用CCK-8溶液及酶联检测仪测定各实验组CD3—CD56+CD16+NK细胞对HepG2、SMMC-7721细胞的杀伤活性，比较各实验组CD3—CD56+CD16+NK细胞对HepG2、SMMC-7721肝癌细胞株杀伤活性的影响。同时观察封闭NKG2D受体时各实验组CD3TD56+CD16+NK细胞对不同肝癌细胞株杀伤活性的影响。　　结果：　　使用免疫磁珠分选法纯化后CD3TD56+CD16+NK细胞纯度较免疫磁珠分选前CD3—CD56+CD16+NK细胞纯度显著增强，同时分选后其对ItepG2和SMMC-7721细胞株的杀伤活性均显著增强。培养14天后，IL-2/IL-15/SCF诱导的CD3—CD56+CD16+NK细胞的扩增倍数、NK细胞表面NKG2D表达以及对HepG2和SMMC-7721细胞的杀伤活性均显著增强，与对照组、IL-2组和IL-15组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。采用NKG2D单抗封闭NKG2D受体后，各组CD3TD56+CD16+NK细胞对HepG2细胞的杀伤作用显著下降，而对SMMC-7721的杀伤活性没有显著影响。　　结论：　　IL-2/IL-15/SCF能增强CD3-CD56+CD16+NK细胞的体外扩增能力、NKG2D的表达水平以及对多种肝癌细胞株的杀伤能力。　　NKG2D途径可能是NK细胞杀伤肝癌细胞的重要机制之一，同时，NK细胞对肝癌细胞的杀伤可能存在着非NKG2D依赖的机制。