三七遗传多样性及三七粉的分子鉴定方法研究

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三七自然分布区狭窄,仅在云南文山、昆明、曲靖、红河及广西百色有大规模栽培。而且,由于三七连作障碍严重,再加上广泛使用所带来的需求量增长以及一些不法商贩的故意炒作,性状相似的同属粉末易与三七粉混用。研究不同产地的三七是否存在遗传变异,建立三七粉的准确鉴定方法,对三七的品种选育和安全有效用药具有重要意义。本研究拟通过DNA条形码技术研究三七的遗传多样性,揭示三七道地性的遗传机制。同时,从DNA条形码、位点特异性PCR和HRM三种方法中筛选最佳分子鉴定方法,建立基于分子-形态的三七粉系统鉴定方法,为三七粉的准确快速鉴定提供依据。本研究的主要结果如下:(1)基于叶绿体基因psbA-trnH, rcbL, matK和trnL-trnF序列,三七几乎无遗传多样性;基于核基因ITS序列,三七具有较低的遗传多样性(hr=0.704)。三七Gsr(-0.007)接近于0,Fsr(-0.003)呈现负值但不显著(P=0.599),AMOVA分析居群内遗传变异达100.27%,均表明三七的遗传变异集中在居群内。云南文山、昆明及广西百色的三七ITS序列基因型较丰富,云南文山和广西百色的基因多态性、核苷酸多态性和Pi值较高,其中云南文山文山县和广西百色靖西县最高,反映了文山县和靖西县为三七的栽培起源中心。(2)基于ITS和trnL-trnF序列的‘核心基因型”,三七的相似度阈值为99%。三七ITS序列存在14个特异位点,种内遗传距离(0.000)小于种间遗传距离(0.027-0.029),与人参和西洋参明显分为两支。三七trnL-trnF序列存在4个特异位点,种内遗传距离(0.000)小于种间遗传距离(0.003-0.006),与人参和西洋参明显分为两支。因此,相似度、特异位点、遗传距离和系统发育树这4个指标均可以用于鉴别三七粉,基于‘核心基因型”的相似度阈值方法是最简单快速的鉴定方法。(3)通过831-833bp(AGAC/ATAA)和732bp(G/C)处设计得到最佳特异引物。退火温度56-59℃时,三七和西洋参分别在150bp和200bp左右出现条带,人参不出现条带,建立了三七的位点特异性PCR鉴定方法。(4)在退火温度54-56℃,引物用量0.8-1.2μL,模板量约0.037-740.211g时,三七,人参和西洋参的Tm值分别为78.14±0.09℃,78.00℃和77.80℃,其熔解曲线具有明显的差异。三七中分别以不同比例(1:1、10:1、20:1、50:1和100:1)掺入人参(西洋参)样品,发现掺伪比例在1:1和10:1时,熔解曲线与纯三七的熔解曲线有显著差异,因此HRM方法可以用于掺伪比例大于10%的三七同属掺伪鉴定。(5)对市场上11份三七粉样品进行鉴定研究,11份样品的显微特征均与三七相符,但其中1份存在花粉粒和气孔等特征。这11份样品的ITS序列与三七ITS序列‘‘核心基因型”的相似度为99.84-100%,trnL-trnF序列与三七trnL-trnF序列‘核心基因型”的相似度为100%,均高于99%相似度阈值。这11份样品的Tm值多在78.0-78.2℃之间,与三七的Tm值(78.14±0.09℃)相近;熔解曲线与三七相似,与人参和西洋参具有明显的差异。因此,可以鉴定这11份三七粉均为五加科人参属三七,不存在超过10%的同属掺伪,其中1份存在地上部位掺伪。综上所述,基于条形码技术三七的遗传多样性较低,能说明文山县和靖西县为三七的栽培起源中心。本研究建立了基于分子-形态的三七粉鉴定方法,首先采用显微鉴定方法鉴定三七是否存在其他科及非药用部位掺伪,再基于‘核心基因型’相似度阈值鉴定三七粉的真伪,最后通过删技术鉴定是否存在掺伪,是最佳的三七粉系统鉴定方法。
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