【研究背景及目的】肝功能衰竭(Acute Hepatic Failure，FHF)是一种死亡率很高的危重病症。内科保守治疗效果有限，而原位肝移植(Orthotopic Liver Transplantation，OLT)又存在种种棘手的难题。用人工肝装置替代生物肝脏的功能，使无肝状态的病人得以生存，这是人工肝研究工作所追求的目标。以往曾用过血液透析、血液滤过、血液灌流和血浆置换等方法，但这些非生物型人工肝仅能替代肝脏部分解毒功能，无法解决肝脏合成、分泌和转化功能，而且会导致一些有用的成分如促肝细胞生长因子被一并清除，因此疗效有限。以体外培养生物细胞为主构成的生物人工肝(Bioartificial Liver，BAL)能更好地模拟生物肝的功能，因而代表了人工肝的发展方向。生物人工肝(BAL)中的核心部分是执行肝功能的肝细胞，直接决定着治疗效果。肝细胞的体外培养方式有许多种，包括单层培养法、聚球体培养、微载体培养、共培养。本研究主要就目前常用的单层平板贴壁培养和聚球体培养这两种方式进行比较，观察这两种方式培养的肝细胞在功能表达上是否存在差异，以寻求一种相对简化的肝细胞体外培养方式，而同时又使其不失良好的结构和功能表达。【研究方法】1．大鼠肝细胞的收获：体重250g左右的6周龄雌性SD大鼠使用4％水合氯醛按10ml／kg行腹腔注射，使用肝素钠按50mg／kg行皮下注射，麻醉后仰卧固定，腹部消毒后按照两步胶原酶灌流法收获肝细胞。2．单层平板贴壁培养：直径7cm平皿中加入0.2ml胶原溶液(0.23mg鼠尾胶原溶解于1ml 0.1％乙酸)，铺层，放置超净台吹干。使用前用无菌PBS洗涤平皿3次，加入8ml预热的含血清培养基。每个平皿接种1.5×10~6cells，轻轻摇匀。二氧化碳培养箱中(37℃，5％CO2)培养4h后细胞贴壁完好，开始形成岛状。一般每2天更换一次培养基。3．聚球体转瓶培养：将新鲜收获的原代人肝细胞用含有0.1 mg／mlⅠ型胶原的培养基混悬。肝细胞接种浓度为1×10~6cells／mL，置入转瓶中密封培养。24小时内细胞形成聚球体。一般每2天更换一次的培养基。4．尿素测定：培养基取样后，自动生化分析仪行尿素氮含量测定。5．白蛋白分析：培养基取样后，白蛋白含量以酶联免疫(ELISA)法测定，吸光度由bio-rad酶标仪在450nm波长下测定。6．细胞活率测定：MTT法，在570nm波长下，以对照孔为参照测定每孔吸光值。【结果】平板贴壁的肝细胞初始细胞包埋量为1.88×10~5cells／mL，转瓶内的初始细胞包埋量为9.97×10~5cells／mL。1．台盼兰定性观察细胞：单层平板贴壁培养的细胞在培养4小时后细胞即贴壁完好，而聚球体转瓶培养的肝细胞则经历了一个“积聚”的过程，24小时内形成聚球体。2．MTT法测定细胞活率：聚球体组在1天内活率下降至原来的70％左右，第3天后稳定在48％左右。而单层贴壁组第1天内即下降至原来的54％左右，第3天后细胞活率稳定在20％左右。聚球体组与单层贴壁组相比(表3-1)具有明显优势(P＜0.01)。3．尿素合成量测定：等量包埋的肝细胞单层贴壁培养和聚球体转瓶培养5天内测定的尿素合成量，单层贴壁组平均值为3.60±0.47mg／dl／d，聚球体组为7.56±0.28mg／dl／d，两组比较(表3-2)有显著性差异(P＜0.01)。按照稳定后细胞活率计算得到的活细胞数分别为：单层平板贴壁0.375×10~5cells／mL；聚球体4.785×10~5cells／mL。按此稳定后细胞活率重新计算发现发现平板贴壁的单个细胞平均尿素合成量为4.3pg／cell／h，聚球体为11.6pg／cell／h。后者有显著优势。4．大鼠白蛋白分泌量测定：方法同尿素合成量的测定。等量包埋的肝细胞单层贴壁培养和聚球体转瓶培养5天内测定的大鼠白蛋白分泌量，单层贴壁组平均值为1249.64±252.48ng／ml／d，聚球体组为3420.2±109.03ng／ml／d，两组比较(表3-3)有显著性差异(P＜0.01)。按照稳定后细胞活率重新计算发现平板贴壁的平均大鼠白蛋白分泌量为0.20 pg／cell／h，聚球体为0.51 pg／cell／h。后者有显著优势。【结论】1、在肝细胞悬液中加入少量的Ⅰ型胶原后，置入转瓶中密封培养，细胞在24小时内就会形成球状聚球体，形成率在50％左右。2、无论是单层平板贴壁培养还是聚球体培养，细胞活率、尿素合成和白蛋白分泌能力在培养的24小时内发生了较大的下降，之后下降较为缓慢。3、培养5天内测定的聚球体的活率、尿素合成和白蛋白分泌能力均明显高于单层平板贴壁培养。