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High mobility group box-1（高迁移率族蛋白1,HMGBl）是HMG家族成员之一，存在于一切真核细胞当中，是细胞核内非组蛋白成分的染色体结合蛋白，序列保守，含量丰富。他们具有稳定核小体；参与DNA转录、复制和DNA修复等功能。近年来的研究显示，HMGB1除在细胞核内与染色体结合行使功能外，还能作为致炎因子在细胞外发挥作用，促进炎症反应，介导内毒素血症的发生。在急、慢性炎症反应中，细胞内和细胞外都可检出HMGBI。HMGB1可以在细胞坏死过程中被动释放到细胞外，还可以由激活的免疫细胞（单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞）主动分泌到细胞外。有研究显示，在系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征等自身免疫性疾病病灶的活组织检查中都有HMGB1的过表达，并且兔和小鼠关节炎动物模型在应用了抗HMGB1的治疗之后症状缓解。证明HMGB1在自身免疫性疾病的致病中作用重大。很多研究发现，HMGB1参与了肿瘤的转移，而且与前列腺癌，胰腺癌等很多肿瘤的不良预后相关。HMGBI与肿瘤的发展和蔓延关系重大，因此以HMGB1作为恶性肿瘤的治疗靶点还有待于更深层次的研究。
1 目的
构建HMGB1真核表达载体，经阳离子脂质体转染进入U937细胞当中进行表达，为今后研究HMGBl的作用机制，HMGBI与单核细胞之间的相互作用，探讨HMGB1在自身免疫性疾病和肿瘤转移中的作用奠定基础。
2 方法
2.1 重组人HMGB1基因真核表达载体的构建
2.1.1 限制性核酸内切酶消化pMD/HMGB1分离HMGBl基因
2.1.2 构建重组载体pCITE-EGFP/HMGBl
2.1.3 菌落PCR鉴定重组载体
2.1.4 酶谱分析鉴定重组载体
2.2 重组真核表达载体pCITE-EGFP/HMGB1转染U937细胞及转染后的表达
2.2.1 阳离子脂质体介导转染U937细胞
2.2.2 倒置荧光显微镜检测阳性转染细胞
2.2.3 Western blot检测HMGBI蛋白表达
3 结果
3.1 重组真核表达载体pCITE-EGFP/HMGB1的构建
3.1.1 用限制性核酸内切酶EcoR I和Sal消化克隆载体pMD/HMGBl得到大小为约648bp的HMGB1目的基因片段
3.1.2 用相同的限制性核酸内切酶酶切制备开环线性载体pCITE-EGFP并用T4DNA连接酶与分离产物人HMGB1基因片段相连接，转化感受态大肠杆菌DH5a菌株，固体LB细菌培养板上有大量菌落长出
3.1.3 以单克隆菌落裂解液为模板，克隆载体pMD/HMGB1为阳性对照，进行菌落PCR扩增，PCR扩增产物电泳结果与阳性对照一致，表明目的基因片段已经插入pCITE-EGFP中
3.1.4 重组质粒经BamH I酶切后，得到4983 bp和1062 bp大小的片段；经Hind Ⅲ酶切后，得到5050bp和995bp大小的片段，均与预期结果相符，也表明目的基因片段已经插入pCITE-EGFP中
3.2 重组真核表达载体pCITE-EGFP/HMGB1转染U937细胞及转染后的表达
3.1.1 倒置荧光显微镜检测结果显示，经过G418筛选的细胞均为表达EGFP的阳性转染细胞
3.1.2 Western blot检测结果显示，转染pCITE-EGFP/HMGBl后的U937细胞HMGB1表达量增多
4 结论
4.1 成功构建重组人HMGB1真核表达载体pCITE-EGFP/HMGB1
4.2 以其转染U937细胞后，外源性HMGB1基因在U937细胞中成功表达