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本论文由四部分构成，一是利用PCR技术克隆出人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)的基因；二是利用大肠杆菌原核表达系统，通过基因重组技术高效表达人GM-CSF；三是对rhGM-CSF的摇瓶培养条件进行优化；四是rhGM-CSF的分离纯化。 1、hGM-CSF基因的克隆 根据hGM-CSF基因的结构特点在不改变蛋白氨基酸顺序的前提下，设计合成了一对PCR引物。经PCR反应得到了修饰后完整的人GM-CSF基因序列。将扩增的人GM-CSF片段插入pMD18-T Vector克隆载体的EcoR I和Pst I酶切位点，转化大肠杆菌XL10-gold后提取质粒。经PCR、酶切、序列分析等多步鉴定，证明克隆的基因片段确为人GM-CSF基因。 2、rhGM-CSF的表达 利用基因工程的方法将测序正确的hGM-CSF基因插入温控型表达载体pDH的多克隆点EcoR I／Pst I，构建重组表达质粒pDH／rhGM-CSF，并将其转化到大肠杆菌DH5α。经42℃温控诱导表达后，rhGM-CSF表达量为16％。 3、rhGM-CSF摇瓶发酵工艺的研究 通过摇瓶发酵对大肠杆菌DHSα／pDH生产rhGM-CSF的培养基、培养温度、诱导时机、诱导表达时间进行了研究，同时也对发酵液的初始pH值、溶氧、接种量、种子菌龄等工艺条件进行了研究，选择了较好的摇瓶培养条件。结果表明，大肠杆菌适宜在32℃进行培养，发酵液初始pH值为7.2-7.4，摇床转速控制在200rpm左右，在对数生长前期升温至42℃诱导4一5小时，可获得较高的表达量。此时由GM一CSF表达量为24.3%。4、r卜GM一CSF的分离纯化研究 采用弱阴离子交换色谱对大肠杆菌表达的thGM一CSF的包含体8.omol.L一’服提取液进行分离纯化。对流动相的组成进行了研究，证明在流动相中加入一定比例的GS川GssG和一定浓度的脉，有利于由GM一CSF复性及分离纯化。经一步纯化，thGM一SF的纯度可达95%，其质量回收率为60%。通过与标准thGM一SCF进行比较，弱阴离子交换色谱对二者进行分离，相同的保留时间和色谱峰型可初步证明离子交换色谱可用于rhGM一SCF的复性与同时纯化研究。