论文部分内容阅读
DARPP-32是参与神经元慢突触传导及调控细胞内多种生物分子磷酸化状态的核心蛋白，是唯一具有PKA和PP1双重抑制作用的分子。近期研究发现DARPP-32在胃癌细胞中有持续的高表达，其作用和机制不明。本研究通过免疫组织化学、Western Blot、细胞培养、基因重组等技术，检测DARPP-32在胃癌、大肠癌组织及细胞系中的表达，探索DARPP-32和胃癌、大肠癌的发生、发展、侵袭、转移的关系，进一步证实DARPP-32的表达与肿瘤相关，为研究其在肿瘤中的机制和功能提供重要的依据。 目的：探讨DARPP-32蛋白在胃癌、大肠癌组织及其细胞系中的表达及其意义；构建DARPP-32正义真核表达载体和DARPP-32特异性siRNA表达载体。 方法：①采用免疫组织化学技术检测DARPP-32在胃癌及大肠癌组织中蛋白质的表达，明确其组织及细胞定位，研究其与肿瘤分化、侵袭、转移的关系。②应用Western blotting检测胃癌组织、大肠癌组织及其细胞系中DARPP-32的表达。③利用DNA重组技术构建DARPP-32编码cDNA的正义真核表达载体并鉴定。④应用siRNA技术构建DARPP-32特异性siRNA表达载体并鉴定。 结果：①免疫组化结果显示，胃腺癌组织中DARPP-32的表达率(92.71％)显著高于正常胃组织(52.63％，P＜0.05)，但DARPP-32表达与胃腺癌的分化、浸润、转移无关(P＞0.05)。②Western blot结果显示，在胃癌患者的癌组织中DARPP-32和剪切产物t-DARPP均有表达，其表达水平显著高于其癌旁组织(t=2.45，P=0.015)，并且以t-DARPP的表达为主。③在人胃癌细胞系中也存在DARPP-32和t-DARPP的表达，而且DARPP-32(32KD)在 第四军医大学硕士学位论文SGC7901耐药细胞株SGC7901/VCR和SGC79OI/ADR中的表达水平较其亲本细胞明显下调。④大肠癌组织免疫组化结果显示DARPP一32特异表达于肠上皮细胞，在大肠腺癌的表达率为78.57%，显著高于正常结肠组织(5 1.67%，P<0.05)，DARPP一32的表达水平与肿瘤的分化、转移和DukeS’分期无关(P>0.05)。⑤Western blot结果显示，DARPP一32和t一DARPP在大肠癌组织的表达水平显著高于其癌旁组织(t=2 .306，P=0.028)，并且以t一DARPP的表达为主。⑥构建了DARPP一32正义真核表达载体和DARPP一32特异性SIRNA表达载体并通过酶切和测序进行了鉴定。 结论:①DARPP一32在胃腺癌组织中的表达增高，其信号转导通路可能存在于胃粘膜上皮细胞并与胃癌的发生相关。②DARPP一32在SGC7901耐药细胞株SGC79OI/VCR和SGC79OI/ADR中的表达水平较其亲本细胞明显下调，DARPP一32可能参与胃癌MDR。③DARPP一32及t一DARPP在结肠癌、直肠癌中表达均上调，两者可能在大肠癌的发生中发挥作用。④DARPP一32正义真核表达载体和DARPP一32特异性SIRNA表达载体构建成功，为下一步的机制研究奠定基础。