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研究目的:系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种慢性系统性自身免疫性疾病,常有多脏器和组织受累。目前尽管药物治疗可以提高患者的临床缓解率和生存期,但是SLE患者仍存在预后不良以及频繁复发的情况。因此,寻找更有效的SLE治疗方法仍具有挑战性,阐明SLE相关的发病机制对SLE的诊断和治疗具有重要意义,对基因技术的改进可能在未来提供一种治疗方法。调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）和辅助性T细胞17（Thelper 17,Th17）是由CD4+T细胞分化而来的两个亚群,在许多自身免疫性疾病的病理过程中扮演着重要角色。其中Treg具有抑制免疫反应的功能,而Th17则表现为促进免疫反应发生。越来越多的研究证实,Treg/Th17比例失衡是导致SLE发展的重要原因。因此,调控Treg/Th17分化可能为治疗SLE提供新的思路。微小RNA（micro RNA,miRNA）是单链非编码RNA,在从细胞增殖和分化到免疫调节等多种生物过程中发挥关键作用。到目前为止,许多miRNA已被确定为SLE诊断和治疗的潜在生物标志物。有趣的是,miR-448驱动促炎Th17细胞分化,加剧炎症疾病的进展。有报道称miR-448在SLE患者血清中高表达,然而miR-448在SLE中的作用及其调控机制尚未被研究。Suppressor of cytokine signaling 5（SOCS5）属于细胞因子信号抑制因子家族,SOCS家族目前已知有8个成员:SOCS1-SOCS7和cytokine-inducible Src homology 2（SH2）protein（CIS）。有研究强调SOCS5可能阻碍Th17细胞的分化。细胞因子信号转导抑制因子家族成员是JAK激酶（Janus Kinase,JAK）/信号转导子和转录激活子（Signal transducer and activator of transcription,STAT）通路的经典抑制剂。SOCS5可抑制内皮细胞中JAK/STAT3信号通路的激活,而激活JAK-SAT3信号通路是促进Th17细胞分化的经典途径,推测在SLE中SOCS5可能通过JAK-STAT3信号通路调控Th17细胞分化。目前有关SOCS5在SLE中的作用研究尚未见报道,因此可作为疾病治疗的新靶点。生物信息学预测显示,miR-448可以与SOCS5的3’-UTR区靶向结合,因此我们推测,miR-448可能通过调控SOCS5在SLE发展过程中起重要作用。综上所述,基于miR-448与炎症和自身免疫等过程的相关性以及SOCS5在免疫调节中的重要作用,提出本研究科学假说“miR-448可能通过调控SOCS5在SLE发展过程中起一定作用,抑制miR-448可能对SLE组织损伤有一定的缓解作用。”为验证该实验假说,本研究拟利用Real-time PCR技术、免疫荧光技术、基因干扰技术、HE染色法、PAS染色法、免疫磁珠分选、流式细胞术、Western blot技术与ELISA等技术手段,阐明miR-448/SOCS5在系统性红斑狼疮中的作用。本研究将为SLE的治疗提供新思路和新靶点,具有重要的理论及现实意义。研究方法:第一部分:分别收集30例未经任何治疗的SLE患者和30名年龄性别匹配的健康体检者血液,分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells;PBMCs）。Real-time PCR检测PBMCs中miR-448的表达。收集临床资料,计算SLEDAI-2000（Systemic lupus erythematosus disease activityindex,SLEDAI）评分,进行统计学分析。第二部分:1、购买8周龄雌性MRL/lpr狼疮小鼠和年龄匹配的雌性MRL/MPJ小鼠,分别饲养4周和12周后,采集脾脏组织备用。实验设置:MRL/MPJ小鼠（8周、12周、20周）、MRL/lpr小鼠（8周、12周、20周）,每组6只。光镜下拍摄小鼠的脾脏,观察脾脏肿大情况。Real-time PCR检测脾脏中mmu-miR-448、SOCS5的表达:免疫荧光检测脾脏中SOCS5的表达。2、选择8周龄MRL/lpr狼疮小鼠,将5×10~6 TU慢病毒介导的miR-448抑制剂（LV-anti-miR-448）或其阴性对照（LV-miR-NC）经尾静脉注射于小鼠体内,每4周注射一次,连续3次,12周后处死小鼠,采集血液、尿液、脾脏、肾脏组织。实验设置:MRL/lpr狼疮小鼠+阴性对照、MRL/lpr狼疮小鼠+miR-448抑制剂。观察两组小鼠脾脏肿大情况,Real-time PCR检测各组脾脏中mmu-miR-448的表达;Western blot检测脾脏中SOCS5的表达:HE染色检测肾脏组织炎症浸润情况:PAS染色检测肾脏组织糖原沉积情况:试剂盒检测血清中抗ds DNA抗体、Ig G、C3、BUN及尿蛋白水平。采集两组小鼠脾脏组织,提取脾细胞,采用Naive CD4+T免疫磁珠分选试剂盒分选Naive CD4+T细胞,孵育并培养细胞,加入单克隆抗体anti-CD25/anti-Foxp3和anti-IL-17A,流式细胞术检测脾CD25+Foxp3+（Treg）和CD4+IL-17A+（Th17）阳性细胞百分比。ELISA试剂盒检测两组小鼠血清中Treg标志性分子（IL-10）和Th17标志性分子（IL-17A）的表达。第三部分:1、双荧光素酶报告系统验证miR-448与SOCS5的靶向关系。2、购买6只MRL/lpr狼疮小鼠（8周龄）,分离培养小鼠脾细胞,用磁珠分离纯化CD4+T细胞,将Naive CD4+T细胞感染LV-miR-NC、LV-anti-miR-44872 h后,Real-time PCR检测细胞中miR-448和SOCS5的表达;western blot检测细胞中SOCS5的蛋白水平。3、分离培养MRL/lpr狼疮小鼠脾细胞,磁珠分离纯化收集Naive CD4+T细胞,将Naive CD4+T细胞感染慢病毒介导的LV-miR-NC、LV-anti-miR-448,24h后诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化,72 h后进行以下实验:Real-time PCR验证细胞中miR-448的表达;Western blot检测细胞中SOCS5的表达;ELISA试剂盒检测细胞上清液中IL-17A的表达;流式细胞术检测细胞中CD4+IL-17A+（Th17）阳性细胞的百分比。4、分离培养MRL/lpr狼疮小鼠脾细胞,磁珠分离纯化收集Naive CD4+T细胞,将Naive CD4+T细胞感染慢病毒介导的SOCS5 sh RNA（LV-SOCS5 sh RNA）或阴性对照（NC sh RNA）,72 h后,Western blot检测细胞中SOCS5的表达。5、用LV-anti-miR-448和LV-SOCS5 sh RNA或LV-NC sh RNA慢病毒共感染分离自MRL/lpr狼疮小鼠（8周龄）的Naive CD4+T细胞24h后,诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化,Elisa试剂盒检测细胞上清液中IL-17A的表达、流式细胞术检测细胞中CD4+IL-17A+（Th17）阳性细胞的百分比。研究结果:第一部分:RT-q PCR检测显示SLE患者的外周血中miR-448水平高于对照组（p＜0.01）。SLE患者miR-448水平与24小时尿蛋白定量呈正相关（p＜0.01,r=0.48）、与SLEDAI评分呈正相关（p＜0.001,r=0.89）,与补体C3呈负相关（p＜0.01,r=-0.54）、与补体C4呈负相关（p＜0.05,r=-0.4）。第二部分:1、通过观察8周龄、12周龄、20周龄小鼠脾脏及淋巴结肿大情况,我们观察到随着病程增加,脾肿大和淋巴结肿大增加。RT-q PCR检测显示,20周龄MRL/lpr小鼠脾脏中miR-448水平显著上调（p＜0.001）,脾脏中SOCS5表达明显下调（p＜0.001）,IF染色进一步验证SOCS5表达下调。2、小鼠感染抑制miR-448慢病毒后,20周龄MRL/lpr小鼠脾脏中miR-448水平显著降低（p＜0.001）,SOCS5水平升高（p＜0.001）。抑制miR-448慢病毒处理组狼疮小鼠血清Ig G和抗ds DNA Ig G含量降低,补体C3浓度升高。抑制miR-448可降低MRL/lpr小鼠24小时尿蛋白和血清BUN水平。抑制miR-448后可减轻小鼠脾肿大和淋巴结肿大。进一步的组织学分析显示未抑制miR-448组小鼠肾脏炎症浸润及胶原沉积情况更加严重,而miR-448抑制后则减弱了肾脏病理损伤。流式细胞术分析显示,miR-448抑制增加了CD4+T细胞中Th17细胞的百分比,降低了Treg细胞的百分比（p＜0.001）。ELISA检测显示miR-448的抑制上调了血清中IL-10的浓度（p＜0.05）,下调了IL-17A的浓度（p＜0.001）。第三部分:1、双荧光素酶报告基因检测显示miR-448模拟物抑制WT SOCS5 3’UTR的荧光素酶活性,而对Mut SOCS5 3’UTR的荧光素酶活性没有影响。2、在感染LV-anti-miR-448慢病毒的na（?）ve CD4+T细胞中,miR-448表达降低（p＜0.001）,而SOCS5蛋白表达升高（p＜0.001）。3、用LV-anti-miR-448或LV-miR-NC感染Na（?）ve CD4+T细胞,刺激Th17细胞分化。结果显示:在Th17分化细胞中,miR-448表达明显上调（p＜0.001）,SOCS5蛋白表达下调（p＜0.001）。LV-anti-miR-448处理导致miR-448表达下调（p＜0.001）,SOCS5蛋白表达上调（p＜0.001）。ELISA显示Th17分化细胞上清IL-17A水平升高,而抑制miR-448处理后降低了其水平。流式细胞术结果显示,miR-448抑制降低了CD4+T细胞中Th17的百分比。提示下调Mi R-448可抑制Th17细胞分化。4、LV-anti-miR-448+LV-SOCS5 sh RNA组中na（?）ve CD4+T细胞SOCS5表达明显低于LV-NC sh RNA组（p＜0.01）,沉默SOCS5后IL-17A浓度增高（p＜0.05）。5、用LV-anti-miR-448和LV-SOCS5 sh RNA或LV-NC sh RNA感染Na（?）ve CD4+T细胞,诱导分化为Th17细胞。发现沉默SOCS5可以部分逆转LV-anti-miR-448对Th17分化细胞中IL-17A浓度的抑制作用（p＜0.01）。流式细胞术显示,SOCS5沉默后Th17细胞比例增加。研究结论:第一部分:Mi R-448在SLE患者中显著上调,并与24小时尿蛋白定量及SLEDAI评分呈正相关,与补体C3、C4呈负相关,提示miR-448可能加速SLE的发展。第二部分:在病程进展的MRL/lpr小鼠中,检测到miR-448在脾脏中的表达增加,SOCS5表达明显下调,提示miR-448和SOCS5都可能参与了SLE的发生发展。抑制miR-448后可以减轻MRL/lpr小鼠的炎症启动和肾功能损失,抑制Mi R-448还可改善狼疮患者肾脏的病理损伤以及脾脏和淋巴结的增大。在MRL/lpr小鼠体内抑制miR-448可显著损害狼疮小鼠脾脏na（?）ve CD4+T细胞的Th17分化并阻断IL-17A的分泌。提示miR-448抑制对SLE具有保护作用。miR-448的抑制改变了Th17/Treg的比例,提示miR-448在SLE中调控了Th17/Treg平衡。第三部分:双荧光素酶报告证实SOCS5是miR-448的直接靶点。抑制miR-448可逆转SOCS5相对表达。从小鼠脾脏中分离出na（?）ve CD4+T淋巴细胞,并在Th17极化条件下培养。与体内结果相似,研究发现LV-anti-miR-448处理后,IL-17极化组Th17细胞比例降低,同时IL-17A水平降低。这些结果表明,抑制miR-448可降低Th17细胞分化,在SLE中发挥有益作用。Western blot实验证实LV-SOCS5 sh RNA能有效抑制na（?）ve CD4+T细胞中SOCS5的表达。流式细胞术显示,SOCS5沉默后Th17细胞比例增加。这些结果表明沉默SOCS5可部分逆转miR-448抑制介导的对Th17活化和IL-17A产生的抑制作用。综上所述,miR-448抑制通过靶向SOCS5来阻止Th17细胞的激活和组织损伤。