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绿僵菌是一种重要的昆虫病原真菌,本实验室已成功构建了绿僵菌在东亚飞蝗体内特异高表达基因的消减文库。本课题选择通过对这些EST序列的生物信息学分析与相关文献的查阅,选择其中一条与RNA多位点结合域蛋白基因Mamrd1基因相关序列进行下一步研究。本研究克隆了Mamrd1基因的全长cDNA(Acc No. HQ268501)。生物信息学分析发现,Mamrd1基因包括3个外显子,2个内含子,并翻译成841个氨基酸的多肽(Mamrd1, Acc No. ADZ99447)。分析该蛋白的一级结构发现,其分子量为92.7 KD,等电点为6.12,进一步分析Mamrd1二级结构与三维构象,发现其与酵母Mrd1基因编码蛋白(Mrd1p)结构相似,均包含5个RBD结构域。本研究采用RNA干扰技术构建了Mamrd1下调工程菌株,通过分析干扰菌株和野生型菌株在1/4SDAY培养基上和宿主昆虫-东亚飞蝗体内的基因表达水平、性状表型和生长特征,分析Mamrd1基因在绿僵菌中的功能。在1/4SDAY培养基中,绿僵菌Mamrd1-RNAi干扰菌株体内Mamrd1基因表达下调了49%。对Mamrd1-RNAi菌株rRNA加工前后的定量分析,证实与酵母中Mrd1基因功能类似,Mamrd1基因参与绿僵菌核糖体35S pre-rRNA的加工过程。与野生型相比,Mamrd1-RNAi干扰菌株生长速率差异不显著,但菌落蓬松,菌丝层增厚。显微观察发现干扰株菌丝分支显著减少,而菌丝分支间隔显著增长,产孢结构变少。干扰株的生物量和产孢量均显著下降,但孢子萌发率与野生型相比无显著差异。在蝗虫体内绿僵菌生长测定试验中,与人工培养基培养基上的菌株相比,绿僵菌在侵染蝗虫后Mamrd1表达上调了13倍。在宿主体内, RNAi菌株的Mamrd1表达下降90%,显著高于体外的干扰效果。生测实验表明干扰菌株对东亚飞蝗的致病力均显著低于野生型。绿僵菌在蝗虫体内生长检测显示,干扰株在宿主血淋巴的生长显著被抑制。综上所述,Mamrd1参与绿僵菌核糖体加工,在绿僵菌侵染致病过程中大量上调表达,影响绿僵菌的生长、产孢和毒力。