天然免疫应答是由能够识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)的受体所介导的,这些受体统称为模式识别受体(Pattern recognition receptor, PRRs)。Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是一类重要的模式识别受体,主要表达于巨噬细胞和树突状细胞(Dendritic cells, DCs)表面,特异性识别病原体中特定的分子结构,激活其下游MyD88或TRIF依赖的信号通路,激活MAPK、NFKB或者IRF3信号,最终激活天然免疫细胞产生炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素,构成机体免疫系统抵御病原体入侵的第一道屏障。TLRs在各种生物体内高度保守,目前在小鼠中已发现12种TLRs。另一类受到广泛关注的模式识别受体是维甲酸诱导的基因Ⅰ样受体(retinoid acid-inducible geneⅠ(RIG-I)-like receptors, RLRs),包括RIG-I和MDA5 (melanoma differentiation-associated gene 5),它们都可以识别胞浆中的病毒RNA。常用于活化RIG-I信号的RNA病毒有水泡口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)、仙台病毒(Sendai virus, SeV)等。RIG-I/MDA5识别相应病毒RNA后,通过招募接头分子IPS-1 (Interferon-beta promoter stimulator 1)等激活下游信号,引起IRF-3以及NF-κB的核转位,最终促进Ⅰ型干扰素和炎性细胞因子产生,激发机体抗病毒反应。TLR及RIG-I不仅启动天然免疫应答,控制炎症反应的性质、强度和持续时间,还可以调节获得性免疫应答的强度和类型,成为连接初始免疫应答和获得性免疫应答的桥梁。所以,TLR及RIG-I信号过度活化或活化不足会导致机体免疫功能异常和疾病的发生。许多其他信号通路参与对TLR及RIG-I信号的严密调控,然而到目前为止,对TLR和RIG-I信号通路调控的分子机制还没有完全研究清楚。因此,对TLR及RIG-I信号转导调控机制的深入研究具有重要的理论意义和应用价值。PHLPP (PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase)是一种具有PH(pleckstrin homology)结构域并且富含亮氨酸重复基序的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶,它由N端的PH结构域、LRR (leucine-rich repeat)结构域、PP2C (protein phosphatase2C)样磷酸酶活性结构域以及C端的PDZ binding结构域组成,大鼠的同源物编码1687个氨基酸。以前的研究发现在大鼠脑组织细胞中,PHLPP能通过其LRR区域直接与K-Ras相结合,负向调控K-Ras和MAPK信号途径；PHLPP也能够抑制ERK通路活化,参与大鼠脑组织长时间记忆的形成。PHLPP在多种肿瘤细胞中低表达,能够通过PP2C样磷酸酶活性区特异性作用于Akt的473位丝氨酸,使其去磷酸化,从而抑制Akt依赖的肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。PHLPP还可以依赖其PH区域使PKC去磷酸化,从而调控细胞内PKC的水平。这些研究提示PHLPP可通过其不同的功能域参与多条信号转导通路的调控。蛋白磷酸酶在免疫应答中的调控作用受到越来越多的重视。已经报道数个磷酸酶,包括SHP-1 (Src homology region 2 domain-containing phosphatase 1)、SHP-2、SHIP-1 (Src homology 2 domain containing inositol-5’-phosphatase-1)和MKP-1(MAPK phosphatase-1)等,分别通过不同的机制调控TLR或RIG-I触发的天然免疫应答中炎性细胞因子和/或Ⅰ型干扰素的产生。那么PHLPP作为另一重要的参与细胞信号转导调控的蛋白磷酸酶,是否参与天然免疫应答中TLR及RIG-I信号转导的调控尚不清楚。本实验分三部分内容对PHLPP是否参与天然免疫的调控以及可能的相关机制等问题进行了研究。一、PHLPP对TLR及RIG-I触发巨噬细胞产生Ⅰ型干扰素的选择性促进作用我们研究发现PHLPP在小鼠脑组织、脾脏及淋巴结等组织和T细胞、B细胞、NK细胞、DC、腹腔巨噬细胞以及RAW264.7细胞株等免疫细胞中广泛表达。并且TLR配体LPS、poly(I:C)刺激以及RIG-I配体VSV感染可以诱导巨噬细胞表达PHLPP蛋白增加。在小鼠巨噬细胞中,用靶向PHLPP的siRNA干扰PHLPP表达,发现可以显著抑制TLR4配体LPS、TLR3配体poly(I:C)以及RIG-I配体VSV诱导的Ⅰ型干扰素的产生,但对炎性细胞因子TNF-α、IL-6的产生无明显影响。另外,干扰PHLPP表达对CpG ODN诱导的Ⅰ型干扰素及炎性细胞因子产生均无显著影响。过表达PHLPP可以显著增强LPS、poly(I:C)以及VSV诱导的Ⅰ型干扰素的产生,而对炎性细胞因子TNF-α、IL-6的产生也无明显影响。细胞因子报告基因结果显示,过表达PHLPP可以显著促进TRIF、组成性活化的RIG-I(RIG I-N)以及MDA5活化的IFN-β报告基因的活性,并且呈剂量依赖性；但对TRIF以及MyD88活化TNF-α报告基因的活性无明显影响,对MyD88活化IFN-β报告基因的活性也无明显影响。通过PB转座子技术建立的PHLPP基因敲除小鼠,其腹腔巨噬细胞中PHLPP表达降低80%以上。实验发现PHLPP基因敲除小鼠的巨噬细胞在体外对LPS.poly(I:C)以及VSV诱导的IFN-α和IFN-β产生水平较野生型小鼠巨噬细胞明显下降,而炎性细胞因子TNF-α、IL-6的水平无明显差异。CpG ODN诱导的炎性细胞因子以及Ⅰ型干扰素的水平在两种细胞中均没有明显差异。在PHLPP基因敲除小鼠骨髓来源的DC中我们也得到了类似的结果。体内试验显示,PHLPP基因敲除小鼠及对照小鼠腹腔注射LPS.poly(I:C)或者VSV后,PHLPP基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞中IFN-α和IFN-β的mRNA水平较对照小鼠均显著下降,而炎性细胞因子TNF-α和IL-6的mRNA水平无明显变化；PHLPP基因敲除小鼠血清中IFN-β水平较对照小鼠显著降低,而炎性细胞因子水平无明显变化。以上研究结果显示PHLPP促进TLR配体诱导的TRIF依赖的以及RIG-I配体诱导的Ⅰ型干扰素的产生,而对其诱导的炎性细胞因子产生以及MyD88依赖的细胞因子产生无明显影响。二、PHLPP选择性调控TLR及RIG-I触发Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究为明确PHLPP各个结构域的功能,我们根据PHLPP的分子结构构建了不同的PHLPP缺失突变载体。瞬时转染这些缺失突变载体后,检测对TRIF活化IFN-β报告基因的活性的影响。结果发现缺失LRR或者PP2C结构域的PHLPP突变体不能促进TRIF活化IFN-β报告基因的活性,而缺失PH或者PDZ结构域的PHLPP突变体仍然能够显著促进TRIF活化IFN-β报告基因的活性；单一表达PP2C结构域的PHLPP突变体不能促进TRIF活化IFN-β报告基因的活性,而表达LRR和PP2C结构域的PHLPP突变体能够显著促进TRIF活化IFN-β报告基因的活性。同时,我们发现在巨噬细胞中瞬时转染缺失LRR或者PP2C结构域的PHLPP突变体不能促进poly(I:C)诱导的Ⅰ型干扰素的产生。由此认为,PHLPP正向调控TLR及RIG-I触发的Ⅰ型干扰素的产生是依赖于其LRR结构域和磷酸酶活性结构域PP2C。接着,我们观察了PHLPP对TLR及RIG-I信号活化的MAPKs、NF-κB的影响。发现PHLPP表达降低对poly(I:C)诱导的ERK、JNK、p38和IKKα/β的磷酸化没有明显影响。同时,报告基因结果显示过表达PHLPP对MyD88、TRIF或RIG-I活化的NF-κB报告基因活性也没有显著影响。因此,PHLPP不能促进TLR及RIG-I触发的MAPKs和NF-κB信号通路的活化,从而对炎性细胞因子产生没有显著影响。那么PHLPP调控TLR及RIG-I信号触发的Ⅰ型干扰素产生的靶分子是什么呢?研究发现过表达PHLPP可以显著促进TBK1和IRF3活化的IFN-β报告基因的活性以及TRIF活化IRF3报告基因的活性,并且均具有剂量依赖性,提示PHLPP在Ⅰ型干扰素产生信号途径中作用在IRF3分子水平。进一步免疫沉淀和GST-pull down实验表明PHLPP可以通过其LRR结构域直接与IRF3的C端相结合。共聚焦显微镜观察显示在巨噬细胞静息状态下PHLPP在胞浆、胞核中均有分布,而IRF3全部在胞浆中；poly(I:C)刺激或SeV感染后,PHLPP有往胞核中聚集的趋势,IRF3转位入核；并且PHLPP与IRF3在细胞核内产生共定位,且分离胞浆、胞核蛋白进行免疫沉淀实验进一步证明PHLPP与IRF3在细胞核内结合。为进一步证明PHLPP调控TLR及RIG-I触发的Ⅰ型干扰素产生的靶分子是IRF3,我们采用了IRF3基因敲除小鼠(IRF3-/-)的腹腔巨噬细胞。实验发现过表达PHLPP对poly(LC)诱导的IRF3-/-巨噬细胞中Ⅰ型干扰素产生没有明显影响。在IRF3-/-巨噬细胞中瞬时转染IRF3质粒以恢复IRF3的表达后,发现过表达PHLPP也恢复了对poly(I:C)诱导的Ⅰ型干扰素产生的促进作用。由此确定PHLPP调控TLR及RIG-I触发的Ⅰ型干扰素产生的信号途径靶分子是IRF3。IRF3作为TLR和RIG-I信号通路的共同下游分子之一,活化后发生磷酸化、二聚体化以及核转位,进而与CBP/P300结合,促进Ⅰ型干扰素的产生,随后IRF3蛋白通过蛋白酶体途径降解,从而保证Ⅰ型干扰素信号活化途径的平衡。我们研究发现PHLPP基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞在poly(I:C)刺激或者VSV、SeV感染后,其IRF3蛋白降解速度较对照小鼠的腹腔巨噬细胞增快；蛋白酶体抑制剂MG132可以完全抑制上述两种细胞中IRF3的降解。过表达PHLPP可以抑制SeV感染诱导的IRF3蛋白降解。PHLPP表达降低之后可以显著增强IRF3泛素化。以上实验结果表明,PHLPP能够与IRF3直接结合并维持IRF3蛋白的稳定,防止其泛素化而降解。那么,PHLPP通过何种机制维持IRF3蛋白的稳定呢?考虑到PHLPP正向调控Ⅰ型干扰素的产生是依赖于其磷酸酶活性结构域PP2C,且有文献报道IRF3 339位丝氨酸(小鼠IRF3 332位丝氨酸(IRF3 S332))磷酸化可以促进IRF3的泛素化和降解,那么PHLPP是否通过使IRF3 S332位去磷酸化而稳定IRF3蛋白呢?我们构建了小鼠IRF3 S332位突变的表达载体(IRF3 S332A)。研究发现在HEK293细胞中瞬时转染PHLPP和野生型IRF3或IRF3 S332A,用SeV感染后,PHLPP对IRF3 S332A的降解和泛素化无明显影响,却可以抑制野生型IRF3的降解和泛素化。同时,报告基因实验显示PHLPP能促进野生型IRF3却不能促进IRF3 S332A突变体活化的IFN-β报告基因的活性。这些实验结果说明PHLPP的作用位点是IRF3 S332。本部分研究结果表明巨噬细胞中PHLPP在细胞核内通过其LRR结构域与活化的IRF3 C端结合,通过其PP2C磷酸酶活性区使IRF3 S332去磷酸化,从而抑制S332磷酸化依赖的IRF3泛素化和降解,维持IRF3蛋白的稳定,促进Ⅰ型干扰素的产生。三、PHLPP通过促进Ⅰ型干扰素产生而参与抵抗病毒感染的作用为探讨PHLPP正向调控TLR及RIG-I触发的Ⅰ型干扰素的产生这一功能在感染性疾病,特别是病毒感染性疾病中的作用,我们首先观察了PHLPP对VSV复制的影响。实验发现PHLPP基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞在VSV感染后,培养上清中VSV病毒滴度(TCID50)显著增加,用培养上清处理的HEK293细胞迅速出现细胞变圆等病毒感染性病变及细胞死亡；而在巨噬细胞培养过程中中加入重组小鼠IFN-β,可以明显降低VSV病毒滴度,减少HEK293细胞死亡率。上述结果表明PHLPP通过促进Ⅰ型干扰素的产生而抑制了VSV的复制。进一步我们取小鼠体内感染VSV 24-48小时之后的脏器检测病毒感染情况,发现PHLPP基因敲除小鼠的肝脏和脾脏组织中VSV的复制和病毒滴度(TCID50)较对照小鼠显著增加,表明PHLPP在体内参与了抵抗VSV感染的效应。本部分研究表明PHLPP通过促进体内TLR及RIG-I触发的Ⅰ型干扰素的产生,抑制VSV的复制,提高小鼠对VSV体内感染的抵抗能力,提示其在抵御病毒感染性疾病中发挥着重要的作用。综合以上三部分研究结果,我们发现磷酸酶PHLPP参与了巨噬细胞中TLR及RIG-I触发的Ⅰ型干扰素产生的正向调控；证明了PHLPP可以通过LRR结构域直接结合胞核内的IRF3,并依赖其磷酸酶活性使IRF3 332位丝氨酸去磷酸化而抑制IRF3的泛素化和降解,维持Ⅰ型干扰素产生的信号通路的持续活化,提高小鼠对VSV感染的抵抗力。本研究揭示了磷酸酶PHLPP在先天免疫应答调控中的作用,丰富了TLR信号及RIG-I信号转导调控的分子机制,为感染性疾病尤其是病毒性感染的免疫治疗提供了新的思路。