引言痴呆是以认知功能进行性减退为特征的综合征,是一种渐进的、退化的脑部疾病,导致认知和情感功能的丧失,最常见于记忆,而其他功能如语言、行为以及最显著的执行功能也常常受损。据估计,全世界约有2400万人患有痴呆症,到2040年,这一数字将增加3至4倍。大约60%是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),10%～20%为血管性痴呆(vascular dementia,VaD),分别占痴呆的第一、二位,其发病机制尚未完全明了。AD特征性病理改变为颞叶海马出现β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结,VaD是由于缺血、出血、低灌注、栓塞、小血管病等血管因素及事件致认知领域损害。在影像学方面,AD是以海马、颞、顶叶皮质萎缩为主的弥漫性萎缩,VaD表现为认知相关区(额叶、颞叶、海马、顶叶、角回、丘脑等)的血管事件(梗死、出血、脑白质病变、腔隙性梗死)。除家族史和一些躯体疾病外,导致痴呆的危险因素主要有:年龄、性别、较低教育、经济水平等。两者在临床表现上各有特点。但在临床实际工作中常难以鉴别。有证据表明,相当部分的AD具有脑血管方面的病理改变,这可能是老龄化的表现之一,也有可能是AD与VaD混合状态的表现之一。同样地,VaD患者脑组织病理检查可以发现诸如老年斑之类AD改变,这可能是混合性痴呆的结果,与正常的老年化进程有关。这就导致人们对这两种疾病的关系和鉴别产生了浓厚的兴趣,这些问题的研究有助于对痴呆发生的病理机制有更加深人的了解,对临床干预策略的制定有很大的推动作用。海马是神经系统中与人类的学习与记忆关系密切的重要功能区,大脑的海马体不但是老年痴呆最早最重要的病变区域,而且也是血管性痴呆的重要受损部位,以往的研究表明,海马神经元凋亡在AD和VaD的发病中均起着重要的作用,并且对缺血低灌注损伤具有明显的易感性。阿尔茨海默氏病(阿尔茨海默病)是一种进行性神经退行性疾病,最终导致神经元不可逆性损伤以及各种智力缺陷,包括认知和记忆。AD已成为重要的公共卫生问题,其症状主要包括躯体、认知、情绪功能的障碍,以及长期的认知和感觉功能退化,这些均明显影响患者的生活质量。当前已有大量有关AD发生和发展方面的研究,并已取得显著成绩,但是这些研究仍然无法提供有效的疾病诊断和治疗技术。这种紧迫的需求激发了神经科学界及医疗行业对AD治疗方法发展的兴趣。根据经典的淀粉样蛋白假说,相对于其他各种淀粉衍生物,Aβ1-42在AD的发病中起着重要的作用。Aβ1-42是由淀粉样前体蛋白(APP)裂解产生的β-分泌酶和γ-分泌酶。Aβ蛋白过量导致淀粉样斑块的形成和各种神经功能障碍包括炎性级联反应的激活启动,tau蛋白磷酸化的推广,氧化应激的增加,细胞内的信号转导通路的管制,突触可塑性的损伤及诱导神经元的凋亡和细胞死亡。越来越多的证据表明,雌二醇可能既促进又会损害记忆相关的过程,因此,雌激素在AD病理过程中所扮演的确切的角色仍然是难以捉摸的。目前,通过向脑内立体定向注射Aβ1-42建立AD小鼠模型。切除小鼠双侧卵巢来观察17β-雌二醇(E2)对AD不同阶段的治疗(早期和晚期)的影响,国内外少见报道,对这一课题的进一步研究无疑具有重要意义。充分证据表明,妇女绝经后循环系统中雌激素水平会突然下降,造成氧化应激风险加大和神经退行过程加快,尤其是那些AD的高危人群。另一方面,实验研究表明,雌性动物(OVX)切除卵巢后的雌激素治疗可改善其学习和记忆过程,提高其在旋臂迷宫和对象识别中的认知能力。在临床情况下,绝经后5年内保持较高雌二醇水平的女性与保持稳定低雌二醇水平的女性相比,前者表现出更优的行为能力。此外,具有较高内源性雌激素水平的绝经后妇女在斯特鲁普任务和空间工作记忆,延迟回忆和数字排序测试方面的能力更为出色。同样,正在服用激素替代疗法的妇女在非空间工作记忆和空间工作记忆任务有更好的反应。然而,也有报道指出雌激素对绝经后妇女认知能力的负面影响。旨在了解这些差异的研究结果表明,若提前应用雌二醇,暴露于Aβ蛋白的神经元所受损伤会显著减少,而若同时或于暴露Aβ蛋白5天后应用雌二醇,神经元则无法获得雌二醇所带来的保护,甚至所受损伤会转而加剧。总之,在阿尔茨海默病的病理过程中雌激素起着微妙又重要的作用,可在不同阶段施加积极或消极的影响。因此,本实验通过研究AD不同病理阶段的17β-雌二醇(E2)治疗(早期和晚期),全面了解E2在AD病理过程中的角色和评估E2作为预防药物的意义。海马是神经系统中与人类的学习与记忆关系密切的重要功能区,大脑的海马体不但是老年痴呆最先最重要的病变区域,而且也是血管性痴呆的重要受损部位,以往的研究表明,海马神经元凋亡在AD和VaD的发病中均起着重要的作用,但SB202190和SB203580对海马神经元凋亡因子表达和学习记忆能力的影响却少有报道,特别是SB202190和SB203580对海马神经元凋亡和Bcl-2、Caspase-3表达影响的研究国内外未见有报道。为了探讨海马神经元凋亡在AD和VaD中的致病机制以及对认知功能的影响,历时6年课题组做了以下3项课题:1.应用雌二醇对AD痴呆小鼠模型海马神经细胞元凋亡的保护作用机制和认知功能影响进行了研究,本研究利用切除双侧卵巢的小鼠,经侧脑室内注射Aβ1-42的方法建立阿尔茨海默病(AD)模型,并给予雌二醇(E2)治疗,研究Aβ1-42诱导的海马神经毒性及分子机制,评价E2拮抗Aβ1-42诱导的海马神经毒性的效果和分子机制。2.应用p38MAPK抑制剂对VaD痴呆大鼠模型海马神经细胞凋亡的保护作用机制和认知功能影响进行了研究,在这项研究中,我们研究了 SB203580、SB202190对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡和学习记忆能力的影响。观察了 p38 MAPK抑制剂对脑细胞凋亡的保护作用,并借助海马依赖性水迷宫试验检测了大鼠的空间参考学习和记忆能力。3.应用TPX2研究对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制。借助海马依赖性水迷宫试验检测了大鼠的空间参考学习和记忆能力。TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡,H E染色观察各组脑组织细胞,Western blot检测ERK和p38 MAPK的表达,采用RT-PCR方法检测MAPK、ERK和p21中mRNA的表达水平。观察了 TPX2对经β1-42处理脑组织的细胞凋亡有保护作用,进一步通过抑制MAPK、ERK和p38蛋白的表达而探讨了其作用机理。总之,课题组通过以上3项研究,旨在进一步阐明p38MAPK抑制剂和雌二醇对痴呆鼠模型海马神经元凋亡的保护作用机制以及对痴呆模型认知功能的影响。第一部分 雌二醇治疗对小鼠阿尔茨海默病模型海马神经元发生及认知功能障碍的早期保护作用目的:本研究利用切除双侧卵巢的小鼠,经侧脑室内注射Aβ1-442的方法建立阿尔茨海默病(AD)模型,并给予雌二醇(E2)治疗。检测Aβ1-42诱导的神经毒性及分子机制;评价E2拮抗Aβ1-42诱导的神经毒性的效果和分子机制。方法:1.双侧卵巢切除术:所有小鼠双侧卵巢切除并立即皮下植入药物,可以持续释放药物60天,内含有E2 0.18毫克。2.动物模型的制备:AD模型组小鼠Aβ1-42(4μg/mouse),缓慢注射(0.5μl/min);安慰剂组小鼠注射等量生理盐水(4μg/mouse)。3.BrdU注射:BrdU连续3次腹腔注射,间隔6小时,给药剂量为50mg/kg。4.雌二醇治疗:(1)早期E2治疗:注射BrdU后第7天双侧海马注射Aβ1-42,后给予7天雌二醇皮下注射,3 μg/day。(2)后期E2治疗:注射BrdU后第7天双侧海马注射Aβ1-42,7天后再给予7天雌二醇皮下注射,3 μ g/day。5.Morris水迷宫实验:计算每组小鼠平均游泳速度、延迟时间。在实验的第8天,撤去隐蔽的水面下平台,观察并记录小鼠的游泳速度及登台潜伏期。6.免疫染色:采用NeuN和BrdU免疫染色检测海马神经的生成。7.ELISA检测:检测促黄体生成激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、雌激素(Estrogen)、孕酮(Progesterone)血清水平。8.RT-PCR:从大脑样本中取出海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。总mRNA采用Trizol试剂提取和RNA反转录与PrimeScriptTMRT试剂盒。9.Western blotting检测信号通路蛋白的表达:从大脑样本中取出海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。蛋白样品的提取采用放射免疫沉淀试验(RIPA)缓冲液。10.cAMP浓度测定:海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。组织颗粒在裂解缓冲液中裂解10分钟,在4℃、14000 rpm离心10分钟,收集上清液并用LANCETM cAMP 384试剂盒测定环磷酸腺苷(cAMP)浓度。11.透射电子显微镜:腹腔麻醉后小鼠,经心脏用2.5%戊二醛灌注并取出海马组织,海马组织继续用2.5%戊二醛固定过夜,在4℃,四氧化锇固定2小时后制作超薄切片(60 nm),用丙酮脱水和醋酸铀染色。结果:1.小鼠海马注射Aβ1-42后,进行Morris水迷宫测试评,估认知功能,特别是空间学习和记忆能力(图1A)。在培训第1-2天,接受Aβ1-42注射的“老年”鼠在发现可见平台的游泳速度或时间延迟上与对照组相比没有差异,这表明空间学习能力不是在Aβ1-42注射后立即受到影响(P>0.05,n=10;见图1A)。相反,改为隐藏平台培训的第3-7天,Aβ1-42小鼠比对照组小鼠时间延迟更长,这些差异在5-7天显著,这表明记忆功能是在Aβ1-42注射后5天开始明显受损(P<0.01,n=10;见图 1A)。从迷宫中去掉平台后,观察小鼠在每个象限停留的时间比例(图1B)。Aβ1-42小鼠在象限虚拟平台的位置所花费的时间百分比明显减少。在本研究中,通过NeuN和BrdU染色标记海马神经元(图1C),染色结果显示Aβ1-42模型组小鼠BrdU注射后21到28天,NeuN、BrdU 阳性细胞数量均显著减少(P<0.01,n=10;图1D)。这些结果表明,小鼠海马神经元在接受Aβ1-42注射后发生严重损害。2.为评估E2对AD小鼠病理过程中早期阶段的影响,在造模后立即给予E2治疗(图2C)。与单纯对照组相比,接受E2治疗的对照组海马神经元再生无明显变化,而Aβ1-42小鼠接受E2治疗与未接受E2治疗比较,NeuN和BrdU 阳性细胞显著增加(P<0.01,n=3;图2D)。此外,给予E2治疗后,AD小鼠找到隐藏平台的潜伏期显著降低(P<0.01,n=10;图2A),在撤出平台的象限所停留的时间比例明显升高(P<0.01,n=10;图2B)。这些研究结果表明,在Aβ1-42小鼠AD病理过程的早期阶段,雌激素治疗增加海马元神经再生并促进认知功能的恢复。3.为评估E2对AD小鼠病理过程中后期阶段的影响,在造模后第7天开始给予E2治疗(图2C)。无论是对照组还是模型组,E2治疗均没有改善海马神经元再生,NeuN和BrdU阳性细胞没有明显变化(P>0.05,n=3;见图3D)。此外,给予E2治疗,并没有降低AD小鼠找到隐藏平台的潜伏期(P>0.05,n=10;见图3A)。在撤出平台的象限停留时间比例没有明显升高(P>0.05,n=10;见图3B)。4.通过测定LH、FSH、雌激素和孕激素的血清水平,确认E2的效果。在E2治疗前FSH,LH,雌激素或孕激素水平没有显著差异(P>0.05,n=6;图4A-D),但在E2治疗后LH、FSH、雌激素水平显著增加,而孕酮水平明显下降(P<0.01,n=6;图 4A-D)。在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,TrkB、BDNF的mRNA及蛋白水平显著上调,而P75NTR表达水平减少(P<0.01,n=3;图4E,F)。这些结果表明,E2诱导的神经发生,至少部分通过BDNF/TrkB通路。对这一途径的下游因子进行了检测(图4E,F)和结果与以前的研究结果相一致,STAT3/CREB/ERK信号通路的激活明显增加(P<0.01,n=3;图4E,F)。本研究还对cAMP水平进行评估,以确认BDNF/TrkB下游信号通路的活化(图4D)。5.与后期E2治疗及未给予E2治疗比较,在早期给与雌二醇的A β 1-42小鼠,NO和ROS的水平明显降低(P<0.01,n=3;图5A)。相应的细胞死亡相关的Cytochrome-c/Bax/Bcl-2/acspase-3 信号通路因子活化下调(P<0.01,n=3;图5B-C)。这些结果表明,E2降低AD病理过程早期阶段海马区的细胞的氧化应激及死亡通路相关因子的活化,促进认知功能的恢复。6.与后期E2治疗及未给予E2治疗比较,在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,胶质细胞增生显著降低(P<0.01,n=3:图6A,B)。E2介导的炎症反应,上调抗炎信号通路的因子活化(CD206,FIZZ1,1、TGFβ)并下调促炎信号通路因子的活化(IL-1β,TNF 和 IL-6。P<0.01,n=3;图 6C-E)。7.在本研究中,使用透射电镜观察海马突触的超微结构。与后期E2治疗及未给与E2治疗比较,发现在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,突触的数量显著增加(P<0.01,n=3;图7A)。为了进一步探讨E2对不同类型突触的作用,采用Western blot对海马NMDA受体和AMPAR受体水平进行分析。NMDA受体(GluN1和GluN2)水平没有明显影响,而AMPAR受体水平(GluA1 GluA2)明显增加(P<0.01,n=3;图7B,C)。此外,还有重要的突触后蛋白Hevin和SPARC表达明显增加(P<0.01,n=3;图7B,C),这两种蛋白在突触的生成及功能方面起着重要作用。结论:1.Aβ1-42小鼠认知功能减退与海马区神经元发生有关。小鼠海马神经元在接受Aβ1-42注射后发生严重损害,海马神经元损害在认知功能障碍方面起到重要作用。2.AD早期阶段E2可增加海马神经元再生并促进认知功能的恢复,而后期阶段E2治疗对的海马神经元再生及认知功能无改善。3.AD早期阶段E2治疗上调Aβ1-42小鼠海马神经元再生相关信号通路。4.AD早期阶段E2治疗可减少氧化应激、下调细胞死亡相关的信号通路活性。5.AD早期阶段E2治疗抑制Aβ1-42小鼠海马小胶质细胞过度增生。6.AD早期阶段E2治疗可增加海马神经元突触受体数量。第二部分 P38MAPK抑制剂对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的保护作用及学习记忆能力的影响目的:本研究利用应用双侧颈总动脉结扎法(2-VO法)制作血管性痴呆(VaD)大鼠模型,经侧脑室内注射SB202190和SB203580的方法对VaD大鼠学习记忆能力进行研究,观察p38MAPK抑制剂对VaD大鼠海马依赖的Morris水迷宫的认知功能所起的作用,并通过研究海马神经元凋亡、海马区P38MAPK磷酸化变化及Bcl-2和Caspase-3表达,研究SB202190和SB203580对血管性痴呆大鼠海马区的神经保护机制,探讨海马神经元凋亡在血管性痴呆的发病机制中所起的作用。方法:利用应用双侧颈总动脉结扎法(2-VO法)制作血管性痴呆(VaD)大鼠模型,随机分为SB202190治疗组、SB203580治疗组、对照组和假手术组。假手术组只分离出双侧颈总动脉并不对其结扎,作为两血管法VaD模型的正常对比。治疗组采用侧脑室注射给药方式分别给予P38MAPK抑制剂SB202190、SB203580,对照组和假手术组采用侧脑室注射给药方式给予等量二甲基亚矾(DMSO),注射药物2周后用Morris水迷宫法测试各组大鼠的学习记忆能力的变化。注射药物后应用TUNEL法检测海马区神经元凋亡,应用蛋白印迹(Western blot)法检测大鼠海马区P38MAPK磷酸化变化,免疫荧光法和激光共聚焦显微镜观察大鼠海马区Bcl-2和Caspase-3表达,以探讨SB202190和SB203580对血管性痴呆大鼠海马区的神经保护机制。结果:1.本研究对平台逃避潜伏期、空间学习、大鼠的SB203580或SB202190治疗效果均进行了研究。结果表明,SB203580和SB202190治疗组平台逃避潜伏期与假手术组和对照组相比明显缩短(**P<0.01),说明大鼠的空间学习能力得以提高。2.给予SB203580和SB202190治疗5天后我们还观察到海马磷酸化激活P38 MAPK表达水平在各治疗组间差异显著(**P<0.01,SB203580治疗组或SB202190组治疗VS假手术组和对照组)。结果显示,SB203580或SB202190治疗后p38MAPK的表达显著降低。SB203580和SB202190治疗组间无显著差异。3.SB203580和SB202190有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡。为了探索SB203580和SB202190是否对血管性痴呆大鼠体外海马细胞凋亡和学习记忆能力有效,本实验用HT22细胞测试SB203580和SB202190的治疗效果。与对照组相比,用SB203580或SB202190治疗后实验组海马神经元凋亡减少。实验也证实了在体内SB203580、SB202190对海马细胞凋亡和血管性痴呆大鼠学习记忆能力是有疗效的。侧脑室注射SB203580和SB202190治疗五天后,处死大鼠,与对照组、SB203580和SB202190组相比,假手术组TUNEL阳性细胞数(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记,绿色荧光)显著下降(**P<0.01)。然而,SB203580和SB202190组与对照组相比,前者TUNEL阳性细胞数目显著降低;而且SB203580组与SB202190组相比,前者TUNEL 阳性细胞较少。总之,SB203580和SB202190有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡。4.本实验研究了 SB203580和SB202190对VaD大鼠海马区施加的抗凋亡能力。脑室注射五天后,处死大鼠获取VaD大鼠海马标本。SB203580或SB202190培养48小时后,进行实验计算实验组凋亡细胞的数量(n=3)。P38MAKA培养后,HT22细胞出现皱缩,碎裂成膜结合凋亡小体,很快被邻近细胞吞噬。P38MAKA能够减少HT22细胞的凋亡。而SB203580或SB202190治疗组凋亡的HT22细胞数量均显著低于对照组。5.在VaD大鼠模型的海马标本上进行了 P38 MAKA和凋亡相关基因之间的关系研究。我们对P38MAKA诱导细胞凋亡相关的mRNA的表达水平进行了分析。与假手术组和对照组相比,细胞凋亡抑制基因BAX和Bcl-2在VaD大鼠海马经SB203580 或 SB202190 治疗后表达增加。caspase-8、caspase-3 和 caspase-9 的表达在SB202190或SB203580治疗组比对照组均显著降低。但SB202190治疗组细胞凋亡抑制基因Bax和Bcl-2的表达比SB203580组略高,这表明SB202190可通过抑制P38 MAKA的活性而减少细胞凋亡,依赖线粒体的凋亡途径可以由慢性缺血激活。6.大鼠经SB203580和SB202190治疗存活时间延长 实验组其余VaD大鼠模型继续存活以观察治疗的远期疗效。假手术组和对照组大鼠在第30天处死。相反,约30%SB202190组和60%SB203580组的动物最后需要处死(**P<0.01)。这说明与SB203580相比,SB202190治疗可进一步延长大鼠的存活时间。其中,相对于SB203580,SB202190较好的治疗效果体现在VaD大鼠显著的生存优势(**P<0.05)结论1.P38MAPK抑制剂SB202190和SB203580,能提高或改善VaD大鼠的学习记忆能力。2.本研究给予VaD大鼠P38MAPK抑制剂治疗后p38MAPK的表达显著降低,有效减少海马神经元细胞凋亡,促进记忆障碍重建,且耐受性良好。3.SB203580和SB202190通过抑制P38 MAKA的活性而减少细胞凋亡,有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡,依赖线粒体的凋亡途径可以由慢性缺血激活。4.大鼠经SB203580和SB202190治疗存活时间延长,与SB203580相比,SB202190治疗可进一步延长大鼠的存活时间。第三部分 TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制的研究目的:研究TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制。方法:将90只大鼠随机分为药物组、对照组和空白组,每组30只。在药物治疗组和空白组大鼠用1 0%水合氯醛麻醉(0.5ml/100g剂量),在大鼠双侧海马区域的准确位置注入Aβ1-425ul(浓度1μg/ul)建立模型。将配置的TPX2抑制剂制成溶液。模型建立后,各组大鼠分别给予不同的治疗方法;药物组大鼠将TPX2-siRNA溶液连接10μl微量注射器给予侧脑室注射10μl,对照组大鼠给予侧脑室注射等量1%DMSO溶液。空白组为正常健康组,本组大鼠未作任何手术或药物治疗。大鼠脑组织分为两个部分,一部分是固定、脱水、石蜡包埋、制成约5um厚度的切片。TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡,HE染色观察各组脑组织细胞,Western blot检测ERK、MAPK和p38的表达水平,采用RT-PCR方法检测MAPK、ERK和p38中mRNA的表达水平。结果:一周后,TUNEL染色显示在药物组脑组织细胞凋亡率明显高于对照组和空白组,差异具有统计学意义(P<0.05);使用TPX2抑制剂后,药物组TPX2的mRNA表达水平显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),分别检测MAPK和p38蛋白的mRNA表达水平,药物组MAPK水平显著高于对照组及空白组,差异具有统计学意义(P<0.05);Western blot灰度值比较中发现,MAPK和p38的表达水平无显著差异,其差异不具有统计学意义(P>0.05)。然而,在药物组中,MAPK、p38表达水平明显高于对照组,空白组MAPK灰度值则明显下降,其差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:因此,TPX2通过抑制MAPK、ERK和p38蛋白的表达抑制经Aβ1-42处理的脑组织细胞发生凋亡,对其有保护作用。